胃癌PTBP3表达状态与中医证型的相关性研究

中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年4月第36卷第4期CJTCMP，April 2021，Vol.36,

No.4• 2057 ••优博专栏•胃癌PTBP3表达状态与中医证型的相关性研究张光涛李朝燕12,韩晨、秦梦梦朱晓虹徐燕黄晨王延文4,赵刚赵爱光1C上海中医药大学附属龙华医院肿瘤一科，上海200032; 2上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院

肿瘤科，上海200437; 3上海交通大学医学院附属f:济医院普外科，上海200120;••上海中医药大学附属龙华医院病理科，上海200032)摘要：H的：通过检测PTBP3在胃癌组织中的表达差异，分析PTBP3表达水平与胃癌脾气虚证的相关性，探

讨胃癌脾气虚证的危险因素。方法：收集胃癌新发病例，根据中医症状调查表进行中医辨证分型，并收集手术或

胃镜石蜡切片，对肿瘤组织进行免疫组化染色，采相关性分析和回归分析以探讨PTBP3与胃癌

脾气虚证的关系结果：共有228例胃癌患者纳人本研究其中，男性169例，女性59例；I期患者28例，II期36

例，III期126例，IV期38例；中医辨证分型为脾气虚证者1(W例，非睥气虚证者119例；PTBP3低表达者97例，高表

达者131例。Pearion分析显示，PTB:.P3表达与脾气虚证具有一定的相关性（/?2=0.166,

P<0.01 ),多因素iog!'5"c

回归分析结果显示，PTBP3高表达和肿瘤家族史为脾气虚证的独立危险因素（P<0.05)。结论：PTBP3表达状态

与胃癌脾气虚证相关；ITBP3高表达是胃癌脾气虚证的独立危险因素：关键词：PTBP3;胃癌；免疫组化；睥气虚证；中医证型；相关性基金资助：国家重点研发计划项El (N〇.2017YFC1700605)，国家科技重大专项（N〇.2017ZX09304-001 )Relationship between PTBP3 expression status and traditional Chinese medicinesyndromes in gastric cancerZHANG

Guang-tao1,

LI

Zhao-yan1HAN

Chen1,

QIN

Meng-meng1,

ZHU

Xiao-hong1,

XU

Yan1,HUANG

Chen3,

WANG

Yan-wen4,

ZHAO

Gang3,

ZHAO

Ai-guang1('First Department of Oncology, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai

200032, China: department of Oncology, Yueyang Hospital. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai200437. China; 'Department of Surgery, Renji Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200120. China: 4Department of Pathology . Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of

Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China )Abstract!

Objective: To explore the the risk factors of gastric cancer with spleen deficiency syndrome, the correlation

between PTBP3 expression level and gastric cancer with spleen deficiency syndrome was analyzed via detecting PTBP3

expression difference in gastric cancer. Methcxls: Patients initially diagnosed with gastric cancer were collected. TCM syndrome

differentiation was performed by TCM symptom questionnaire. The tumor tissues after operation or gastroscopy were obtained for

immunohistochemical staining.

Pearson correlation and

Logistic regression were used to analyze the relationship between PTBP3

and gastric cancer with spleen deficiency syndrome. Results: A total of 228 cases (169 male patients and 59 female patients) of

gastric cance were included in this study. The conditions of patients respectively are: stage

I (28 cases), stage

II (36 cases).

III

stage (126 cases), stage

IV (38 cases); spleen-deticiency syndrome (109 cases), non spleen-deficiency syndrome (119 cases), low

expression of PTBP3 (97 cases), high expression of PTBP3 (131 cases).

Pearson analysis showed a certain correlation (/?:=0.166,

^) between PTBP3 expression and spleen deficiency syndrome. Multiple

Logistic regression analysis showed that cancer

family history and the high expressdon of PTBP3 were two independent risk factors from spleendeficiency syndrome (尸<0.05).通信作者：赵爱光，上海市徐汇K宛平南路725号上海中医药大学附属龙华医院肿瘤一科，邮编：200032,电话：************E-mail： *****************

• 2058 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年4月第36卷第4期CJTCMP，April 2021，Vol.36,

No.4Conclusion: The expression status of PTBP3 is closely related to spleen deficiency syndrome in gastric cancer. High expression of

PTBP3 is an independent risk factor for gastric cancer with spleen deficiency Words： Polypyrimidine tract binding protein 3 (PTBP3): Gastric cancer: Immunohistochemistry; Spleen deficiency

syndrome; TCM syndrome; RelationshipFunding!

National Key R&D Program of China (No.2017YFC1700605), National Science and Technology Major

Project (N〇.2017ZX09304-0()1)2018年全球新发胃癌患者约100万，共78.3万

人死亡，是世界癌症发病率第五、病死率第三的恶

性肿瘤|1]。胃癌肿瘤异质性强，复发转移率高，预

后差Ul。我国中西医结合治疗胃癌已成为特色，由于

胃癌存在证型差异，例如，有研究表明不同证型之

间E-钙黏蛋白、血管内皮生长因子、组织基质金属

蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase,

TIMPs)等基因与蛋白质表达上存在差异1 W51,因此，

了解不同证型的分子病理特点有助于胃癌中医理论

基础研究和抗肿瘤中药的选择。选择性剪接是由前

体m R N A经过不同剪接方式产生不同成熟m K N A的

过程，PTBP3 (polypyrimidine tract binding protein 3)

是R N A结合蛋白，作为负调控因子可以抑制选择性

剪接PTBP3参与前体mRNA选择性剪接调控，剪接

调控功能紊乱可以引起肿瘤等多种疾病，并影响癌

细胞的生物学行为161胃癌中PTBP3高表达的状态与

低分化癌密切相关提示预后不良|71。本研究使用免

疫组化SP法检测胃癌组织中PTBP3表达状态，结合

患者中医辨证分型以及年龄、性别、个人史、肿瘤家

族史、TNM分期、神经脉管侵犯等临床病理特征，分

析PTBP3表达与中医证型及各因素间的相关性，初步

探讨胃癌中医证型的分子生物学基础。资料与方法I.研究对象2018年6月至2019年10月在上海

中医药大学附属龙华医院和上海交通大学医学院附

属仁济医院普外科就诊的未经任何治疗的新发胃癌

患者228例，所有患者均根据《中国常见恶性肿瘤诊

治规范》m以胃镜或手术病理学分型诊断明确为腺

癌，依据国际抗癌联盟和美国抗癌联合会（AJCC/

UICC)胃癌TNM分期第8版191进行临床病理分期。收

集患者出生年月、性别、烟酒史、肿瘤家族史等人口

学指标，肿瘤部位、Lauren分型、侵犯层次（T)、区

域淋巴结（N)、远处转移（M)等病理相关信息，手

术患者收集新鲜组织或病理切片，未手术患者收集

胃镜活检病理切片本研究在

登记，上海中医药大学附属龙华医院伦理批件号为

2018LCSY014,上海交通大学医学院附属仁济医院伦理批件号为2018-120;本研究所有患者均签署了知

情同意书。2. 纳人及排除标准2.1纳人标准①病理学诊断为腺癌；②TOM分

期明确；③发病年龄&18岁；④Karnofsky体力状况评

分為70分；⑤患者知情同意，并签署知情同意书；⑥

同意提供组织学样本。2.2排除标准①二重或多重癌患者；②妊娠、

哺乳期妇女，精神病患者；③合并有心肌梗死、脑梗

死、严重肝肾功能不全、术后严重并发症等可能严重

影响治疗和预后的急慢性疾病患者。3. 试剂及设备一抗为山羊抗人PTBP3多克隆

抗体（1 : 50; Santa Cruz Bioterhnology，Saiila Cruz,

CA, USA); SP法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博十德公司）；免疫组化专用黏附片（福州迈

新公司）；抗体稀释剂（北京中杉金桥公司）；酒精、

二甲苯（西陇科学股份有限公司）；中性树胶（上海

懿洋仪器有限公司）。KM2135型切片机、ASP300S全

自动全封闭式脱水机（德国Leica公司）；Olympus显

微镜照相机（日本Olympus公司）。4. 免疫组化染色步骤组织离体后及时10性甲醛固定，梯度酒精脱水、浸蜡，常规石蜡包埋，

连续切片厚度为3〜4ixm,方向一致漂在免疫组化

专用粘附片上，65t烤片lh,二甲苯脱蜡，梯度酒精

脱水至水化后，PBS清洗，pH9.0的EDTA加热煮沸

20min,置于H202, PBS冲洗，室温孵育一抗，PBS冲

洗，加人二抗，DAB显色，镜下观察终止反应，苏木

素复染，脱水并透明，中性树胶封片，严格按照SP免

疫组化试剂盒说明书操作。一抗浓度为1 : 1〇〇,设置

阴性对照和阳性对照。5. 结果判定由3位病理医师在双肓的情况下

独立完成PTBP3免疫组化评分。光学显微镜下，根据

切片肿瘤细胞染色强度和阳性细胞比例计算分值。

肿瘤细胞中阳性细胞比例：未染色，〇分；矣10%, I

分；>10%~50%，2分；>50%~75%，3分；>75%, 4

分。染色强度按以下标准计算：无着色，〇分；淡黄

色，1分；棕黄色，2分；黄褐色，3分。最终免疫组化%中

中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年4月第36卷第4期CJTCMP.

April 2021,

Vol.36.

No.4•

2059 •结果为染色强度和阳性细胞百分率的乘积，得到最小分

数为〇、最大分数为12的评分。结果判定:0〜1分，阴性；2 ~3分，弱阳性;4 ~ 6分，阳性；>6分，强阳性。6.

商表达59例，低表达60例检验结果提;脾气虚

证患者的PTBP3表达水平显著高于非脾气虚证患者

(Ac0_05) 〇3.2脾气虚证和PTBP3表达的相关性Pearson

中医辨证分型标准患者人院后填写中医症

状调查表，根据四诊收集患者治疗前中医信息，详

细记录与辨证相关的症状、体征、舌苔、脉象等。根

据2011年国家中医药管理局颁布的《胃癌中医诊疗

方案》[w]进行辨证分型。临床症状出现腹胀纳少，食

后胀甚，大便溏薄，肢体倦怠，神疲乏力，少气懒言，

形体消瘦，或肥胖，浮肿，面色萎黄，舌淡苔白，脉

缓弱，以食少、腹胀、便溏与气虚症状共见为辨证要

点。有上述症状者辨证为脾气虚证，不明显则辨证为

非脾气虚证。非脾气虚证包括胃阴虚证、血虚证、脾

肾阳虚证、热毒证、痰湿证、血瘀证、肝胃不和证37. 统计学方法使用SPSS丨9.0软件进行数据分

析,计数资料采用/检验，计量资料采用?检验或秩和

检验，相关系数进行相关性分析，单因素分

析和多因素L〇g/W/c回归进行脾气虚证的危险因素分

析，所有统计分析的显著性水准为a=0.05,以P<0.()5

为差异有统计学意义。结果1. 人组胃癌患者的临床基本特征见表1。该研

究共纳人新发胃癌患者228例。其中，男性169例，女

性59例，男女比例为2.86 : 1。年龄范围在31〜90岁，中

位年龄65岁。有吸烟史者91例，饮酒史者68例，肿瘤

家族史者48例。胃食管结合部肿瘤50例，胃部肿瘤

178例。肠型胃癌135例，弥漫型胃癌65例，混合型胃

癌28例。TNM分期为I期者28例，II期36例，III期126

例，IV期38例，中医辨证为脾气虚证者109例，非脾气

虚证者119例。2. 胃癌组织中PTBP3表达分布特征胃癌PTBP3蛋白定位于细胞核和细胞质，光镜下免疫组

化染色呈棕褐色，评分标准见图1。228例患者中，

PTBP3蛋白阴性患者27例（11.8%);弱阳性患者70例(30.7%);阳性患者85例（37.3%);强阳性患者46例

(20.2%)。本实验将PTBP3蛋白阴性和弱阳性视为

阴性表达，阳性和强阳性视为阳性表达，其中，阴性

表达者97例，阳性表达者131例。3. PTBP3与脾气虚证的关系3.1脾气虚证和非脾气虚证患者两组间PTBP3

表达差异109例脾气虚证患者中，PTBP3高表达

72例，低表达37例；119例非脾气虚证患者中，PTBP3分析显示PTBP3表达与脾气虚证具有一定的相

关性166, P<0.05 )。单因素Log/s//c回归

分析显示，肿瘤家族史（P=0.023)、PTBP3表达表1 228例胃癌患者的基本临床特征脾气虚证（例）因素巧旧否是年龄<65岁55540.616多65岁6455性别男85840.332女3425吸烟史否72650.893是4744饮酒史否85750.666是3434肿瘤家族史否101790.022是1830肿瘤部位胃食管结合部27230.772胃部9286Lauren分型肠型72630.801弥漫型3431混合型1315TNM分期I2080.104n1818in5967IV2216

• 2060 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年4月第36卷第4期CJTCMP,

April 2021.

Vol.36,

No.4表2各临床因素与脾气虚证的多因素回归分析SE0.3400.2940.3550.3620.3530.342-0.4540.486-0.5600.4930.3930.292Wald0.7670.8940.0450.0085.3590.0080.0080.0060.0084.1390.9470.3670.8746.691户值0.3810.3440.8330.9280.0210.9280.9960.9380.9290.2470.3310.5450.3500.010OR因素性别发病年龄吸烟史饮酒史肿瘤家族史原发部位Lauren分型弥漫型us肠型混合型w肠型TNM分期11期vsl期mB-0.298-0.2780.0750.0330.8170.031--0.035-0.043--0.5450.2990.3680.75595%CI|0.381, 1.446](0.425, 1.348J[0.537, 2.163][0.509, 2.099][1.134, 4.524][0.528, 2.015|-|0.396, 2.352J[0.369, 2.485]-[0.194, 1.738]|().5I3, 3.542][0.668, 3.123]|1.201, 3.768]0.7420.7571.0781.0332.2641.032-0.9650.958-0.5801.3481.4442.127期mi期IV期vsl期PTBP3表达(P = 0.01 2 )是影响脾气虚证的危险因素，而性别

(尸=0.333)、年龄（P=0.616)、吸烟（P=0.893)、饮

酒史（P=0_666)、原发部位（P=0.772)、Lauren分型

(P=0.802)、TNM分期（_P=0.115)则不是。将性别、

发病年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤家族史、原发部

位、Lauren分型、TNM分期、PTBP3表达9个因素纳

人Log/67/c多因素回归模型，选择Enter法进行变量筛

选。表2结果显示，肿瘤家族史（P=0.021)和PTBP3

高表达（户=〇.〇丨〇)为脾气虚证的独立危险因素。讨论尽管胃癌的发病率有所下降，新型生物制剂的

开发以及综合治疗策略的发展，胃癌的预后依然很

差。胃癌在中医学中属“积聚”“胃反” “胃脘痛”等

范畴，目前诸多医家认为胃癌发展过程中病机以脾

虚为主，阴虚、血瘀、气滞和热毒并见，兼见痰浊和

湿邪，在疾病进展中虚实各有主次轻重|IM。上海市名

中医、著名中西医肿瘤学专家邱佳信教授在长期的临

床实践中总结出，脾虚状态贯穿于消化道肿瘤的发生

发展过程中，并将健脾法作为基本的治疗法则|121。赵

爱光教授对慢性萎缩性胃炎、胃黏膜上皮异型增生、

早期胃癌和进展期胃癌患者的主要脾虚症状进行半

定量计分，结果显示不同病变脾虚程度有异，脾虚与

胃癌发生、发展呈等级正相关，提示脾虚可能是胃癌

发病过程中主要的病机变化郑嘉怡等^发现在

胃癌前病变脾虚证大鼠胃黏膜基础上发生肠上皮化生和异型血管与微血管新生等形态学异常可恶变成

胃癌，可见脾虚在胃癌发生、发展中起到重要作用。

本研究228例患者中，脾气虚证109例，占比47.8%，显

著高于其他证型。此外，国内多名学者在胃癌回顾性

研究、前瞻性临床调查中，分别统计出胃癌中医证型

分布规律，发现胃癌最常见中医证型为脾气虚型|1VI71,

与本研究结论一致3选择性剪接是控制基因表达和增加蛋内质组复

杂性的重要机制|181,为基因转录后调控机制之一，受

SK蛋白家族和hnRNP蛋白家族的调控|191。SR家族为

激活蛋白，穿梭于细胞核和细胞质之间的hnRNP蛋白

家族为选择性剪接抑制蛋白，两者与其它剪接调控因

子相互作用的结果对剪接位点的选择非常重要|M|。

PTBP3属于hnRNP蛋白家族成员，与胃癌关系密切。

本课题组前期研究发现，肿瘤组织PTBP3表达量较

正常胃黏膜明显增高|2U;本研究中，PTBP3阳性表达

病例131例，占57.5%,另有弱阳性患者70例（若开发

出高度特异性和敏感性的PTB P3抗体，统计结果将

更明确），表明胃癌组织中PTBP3处于高表达状态。

此外，课题组研究证明，抑制PTBP3可诱导胃癌细胞

凋亡、阻滞细胞周期、增强胃癌细胞对5-FU的化疗敏

感性1221;并且转移性胃癌肿瘤组织中PTBP3表达明显

增高，高表达较低表达患者生存期缩短，提示PTBP3

是促进转移的基因，PTBP3可作为胃癌的生物标志物

或潜在的治疗靶标|231。

中华中医药杂志(原中国医药学报)2021年4月第36卷第4期CJTCMP.

April 2021,

Vol.36,

No.4• 2061 •本研究为进一步探索胃癌中医证型的实质，收

集胃癌患者临床资料，结合PTBP3表达状态，使用

Peoroow相关性分析和多因素Zog/it/c•回归分析，证明

脾气虚证是胃癌发生发展的基本病机要素之一，脾

气虚证中存在PTBP3高表达，PTBP3的高表达是胃

癌脾气虚证分子机制之一，并提示PTBP3阳性和有

肿瘤家族史的患者有更高的脾气虚证的风险，可能

导致肿瘤出现转移，患者预后差。目前国内外在胃癌

PTBP3领域的研究相对较少，本课题组通过长期的

基础与临床研究，提示PTBP3可以作为免疫组化新

的检测指标协助胃癌临床诊断，并可以作为胃癌脾气

虚证的监测指标，后续将进一步研究PTBP3在胃癌

中的作用机制，例如与免疫微环境的关系等，以筛选

出新的治疗靶点，为胃癌治疗提供方向。参考文献[1]

Bray

F,Ferlav

J,Soerjomataram

I,et

cancer

statistics

2018:GLOBOCAN

estimates

of

incidence

and

mortality

worldwide

for 36

cancers

in 185

Cancer

J

Clin,2018,68(6):

394-424[2]

Cancer

Genome

Atlas

Research

Net

work.

Cancer

comprehensive

molecular

chaiaclerization

of

gastric

,2014,

513(7517):202-209[3] 孙春霞.赵普辉.范焕芳，等.胃癌中医证型与基因、蛋白相关

性研究现状.中国中医基础医学杂志，2018,24(9): 1335-丨338[4] 许玲浏龙，孙大志，等£-钙粘蛋白与胃癌中医证型关系的研究.

成都中医药大学学报，2004(4):40-43[5] 钱建华，林海燕.胃癌中医证型与病灶组织中P53、VEGHER-2蛋白表达的相关性研究.中华中医药学刊，2015,33(4):

1005-1008[6]

Elisabeth

D,Gwendal

DJuan

pathogenicity

of

splicing

deferts:merhanistir

insights

into

pre-mRNA

processing

infomi

hovel

therapeutic

Rep.2015,16(12):1640-1655[7]

Chen

B,Chen

W

A

G,et

3

induced

inhibition

of

rlifferentialion

of

gastric

cancer

cells

through

alternative

splicing

of

I(U

.Front

Oncol.2020,10:1477[8] 中华人民共和国卫生部医政司.中国常见恶性肿瘤诊治规范.北京:北京医科大学，中国协和医学大学联合出版社,1991[9]

Amin

M

B,Edge

S

B,Greene

F

(X

Cancer

Staging

Manual.8th

York:Springer,2016:203-220[10] 国家中医药管理局重点专科胃癌协作组.胃癌中医诊疗方案.

北京:国家中医药管理局，2011[11] 陈静，赵爱光，曹妮达，等.胃癌前疾病、癌前病变、胃癌与脾

虚证的研究进展.中华中医药学刊,2013,31 (7): 1654-1657[12] 邱佳信，带津良一.四宫义也，等.岐黄之术在肿瘤防治中的应

用-中日医师之间的对话之一上海中医药杂志,1994,28(12):1丨13]赵爱光，杨金坤郑坚，等.脾虚与胃癌发生、发展的相关性研究.

上海中医药杂志，1998,32(5): 10-12[14] 郑嘉怡，赵自明，潘华峰，等.胃癌前病变脾虚证大鼠胃黏膜

病变的病理与超微结构研究.中华中医药杂志，2018.33(5):

1730-1735[15] 陈涛，李丹.胃癌中医证型的文献分析.时珍国医国药^2006.17(4):

661-663[16] 许玲，魏品康,秦志丰，等.胃癌中医证候特点分析767例.世界

华人消化杂志,2005,13( 15): 1804-1808[17] 刘莺，朱文锋，卢芳国，等.152例胃癌患者术前病证聚类与主

成份分析.江苏中医药，2004,25(6):20-22[18]

Kalynam,Simpsoncg,Syednh,et

ative

splicing

and

nonsense-mediated

decay

modulate

expression

of

important

regulatory

genes

in

c

Acids

Res,2012,40(6):

2454-2469f 19]

Spellmanr,Llorianm,egulation

anti

functional

redunrlancy

between

the

splicing

regulator

PTB

anrl

its

paralogsnPTB

and

Cell,2007,27(3):420-434[20]

T

F

BrazaoJ

Demmers,W

van

Ijcken,et

al.A

new

fiinction

of

ROD 1

in

noasease-mediated

mRNA

decay

.FEBS

Lett^012,586:l 101-1110[21]

Chen

B,Zhao

A

J,et

effects

of

PTBP3

silencing

on

the

proliferation

and

differentiation

of

MKN45

human

gastric

cancer

Sci,2014,114(l):29-35[22]

Liang

X,Shi

H,Yang

L,et

tion

of

polypyrimidine

tract-

binding

protein 3

induces

apoptosis

and

cell

cycle

arrest,and

enhances

tlie

cytotoxicity

of 5-fluorouraril

in

gastric

cancer

J

Canrer,2017.116:903[23]

Liang

X,Chen

W

X,Shi

H

Y,et

3

contributes

to

the

metastasis

of

gastric

cancer

by

mediating

CAV1

alternative

Death

and

Disease,2018,9:569(收稿日期：2020年11月28日）F及