admin 管理员组文章数量: 1184232
2024年3月20日发(作者：匿名聊天官网)
·
８９４
·
ＤＯＩ１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．１２．０４
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉＤｅｃ．２０２０Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１２
，，，
：
胞的侵袭
ＬｎｃＲＮＡＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
促进三阴性乳腺癌细
·临床实验研究·
王琴
，
唐莉
（
江苏省肿瘤医院
＆
江苏省肿瘤防治研究所
＆
南京医科大学附属肿瘤医院检验科
，
南京
２１０００９
）
ＬｎｃＲＮＡ
）
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合果糖二磷酸醛缩酶
Ａ
（
ｆｒｕｃｔｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
，
ＡＬＤＯＡ
）
摘要
：
目的
探索长链非编码
ＲＮＡ
（
ＭＤＡＭＢ２３１
）
对三阴性乳腺癌细胞
（
侵袭的影响
。
方法
采用
ＲＮＡｐｕｌｌｄｏｗｎ
试验
、
质谱分析和
ＲＮＡ
免疫共沉淀试验检测并
ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ
，
ＴＣＧＡ
）
采用癌症基因组图集
（
中的侵袭性乳腺癌阵列分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
之间的相互作用
；
ＲＴＰＣＲ
和
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
分析三阴性乳腺癌细胞中
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
失调对
ＡＬＤＯＡ
表达
分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
表达的相关性
；
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
试验分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
对乳腺癌侵袭能力的影响
。
结果
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
在乳腺癌细胞内与
ＡＬＤＯＡ
的影响
；
Ｐ＜０．０１
）
ｒ
＝
０．１９
，
Ｐ＜０．０１
），。
与阴性对直接结合
。
ＡＬＤＯＡ
在
ＴＣＧＡ
乳腺癌阵列中高表达
（
并与
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的表达呈正相关
（
照组相比
，
干扰
ＡＬＤＯＡ
能抑制
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
对
ＭＤＡＭＢ２３１
细胞的促侵袭功能
。
结论
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
通过与
ＡＬＤＯＡ
直接结合
促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭
。
关键词
：
乳腺癌
；
侵袭
；
长链非编码
ＲＮＡ
；
果糖二磷酸醛缩酶
Ａ
Ｒ４４６
；
Ｒ７３．３７
文献标志码
：
Ａ
中图分类号
：
ＬｎｃＲＮＡＤＣＳＴ１ＡＳ１ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＡＬＤＯＡｐｒｏｍｏｔｅｓｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎ
ＷＡＮＧＱｉｎＴＡＮＧＬｉＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＪｉａｎｇｓｕＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ＆ＪｉａｎｇｓｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ＆ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａ
ｔｅｄＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＮａｎｊｉｎｇ２１０００９ＪｉａｎｇｓｕＣｈｉｎａ
ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡＤＣＳＴ１ＡＳ１
，（
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１ａｎｔｉｓｅｎｓｅ１
）
ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
（
ＡＬＤＯＡ
）
ｏｎｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ
ＭＤＡＭＢ２３１
）
．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＲＮＡｐｕｌｌｄｏｗｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
，
ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＮＡｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｅｒｅｕｓｅｄｃｅｌｌｓ
（
ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＤＣＳＴ１ＡＳ１ａｎｄＡＬＤＯＡ．ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓａｒｒａｙｉｎＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ
（
ＴＣＧＡ
）
ｗａｓ
ｏｆｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＤＣＳＴ１ＡＳ１ｏｎＡＬＤＯＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＴｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＤＣＳＴ１ＡＳ１ｃｏｍｂｉｎｅｄ
ｗｉｔｈＡＬＤＯＡｏｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＤＣＳＴ１ＡＳ１ｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄｓｔｏＡＬＤＯＡｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＡＬＤＯＡｗａｓｈｉｇｈｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＴＣＧＡｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒａｒｒａｙＰ＜０．０１
：
，
，
，，）
（
ＤＣＳＴＡＭＰｄｏｍａｉｎ
ｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＤＣＳＴ１ＡＳ１ａｎｄＡＬＤＯＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＲＴＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓ
ｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈＡＬＤＯＡｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｉｎｖａｓｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＤＣＳＴ１ＡＳ１ｏｎＭＤＡＭＢ２３１
ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＤＣＳＴ１ＡＳ１ｍａｙｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄｔｏＡＬＤＯＡｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｉｎｖａｓｉｏｎｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｆｒｕｃｔｏｓｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
，
（
Ｐ＜０．０１
）
．Ｃｏｍ
），
ａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＤＣＳＴ１ＡＳ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
（
ｒ
＝
０．１９
，
三阴性乳腺癌（
ｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ
，
ＴＮ
ＢＣ
）
ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ
，
ＥＲ
）是雌激素受体（、孕激素受
体（和人表皮生长因子受
ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ
，
ＰＲ
）
体
２
（
ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ２
，
均为阴性的异质性疾病，具有侵袭程度高、
ＨＥＲ２
）
易远处转移等特点，是乳腺癌中预后较差的亚型，而
寻找有效的分子诊断指标和治疗靶标是解决这一困
境的有效途径。
ＤＣＳＴＡＭＰ
域包含
１
反义链
１
（
ＤＣＳＴＡＭＰ
ｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１ａｎｔｉｓｅｎｓｅ１
，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
）是本课
ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ
，题组采用长链非编码
ＲＮＡ
（
：；；；
）芯片在
ＴＮＢＣ
组织中筛选获得的上调表达
的
ＬｎｃＲＮＡ
并证实
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
可作为
ＴＮＢＣ
有效的
分子诊断指标，且能够通过与
ｍｉＲ８７３５ｐ
和致癌基
因
ＭＹＣ
形成正调控环以促进
ＴＮＢＣ
细胞的增殖和
转移
［］
。此外，笔者还发现
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
可以通过与
膜联蛋白
Ａ１
（
ＡＮＸＡ１
）结合通过促进上皮
－
间质转
ＥＭＴ
）化（以增强
ＴＮＢＣ
细胞的化学耐药性
［］
。本
研究拟进一步分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
通过结合果糖二磷
酸醛缩酶
Ａ
（
ｆｒｕｃｔｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅＡ
，
ＡＬ
ＤＯＡ
）促进
ＴＮＢＣ
细胞侵袭的机制。
ＬｎｃＲＮＡ
１
２
国家自然科学基金（；江苏省自然科学基金（。
８１８０２８９８
）
ＢＫ２０１８１０９０
）
基金项目
：
作者简介
：王琴，女，主管技师，大学本科，从事肿瘤标志物的相关研究。
１９７５
年生，
通信作者
：唐莉，副主任技师，
Ｅｍａｉｌ
：
ｔａｎｇｌｉ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
。
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
１
材料和方法
１．１
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉＤｅｃ．２０２０Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１２
，
细胞系、主要试剂及仪器
三阴性乳腺癌细胞
系
ＭＤＡＭＢ２３１
和
ＢＴ５４９
（中国科学院上海细胞
库），上海康成公司），
ＬｎｃＲＮＡ
芯片（
Ｌ１５
培养基、
胰蛋白酶
－
ＥＤＴＡ
（和胎
ＲＰＭＩ１６４０
培养基、
０．２５％
）
均购自美国
Ｇｉｂｃｏ
牛血清（
ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ
，
ＦＢＳ
）
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ
试剂盒和
ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘ
公司，
日本
ＴａＫａＲａ
公司），
ＭａｇｎａＲＩＰＴａｑ
Ⅱ
试剂盒（
美国
ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉＲＮＡ
结合蛋白免疫沉淀试剂盒（
ＴＭ
·
８９５
·
２
×
）
１０
μ
Ｌ
，
Ｔａｑ
Ⅱ
（上、下游引物（
１０
μ
ｍｏｌ／Ｌ
）各
０．８
μ
Ｌ
，
ＤＮＡ
模板
２
μ
Ｌ
，灭菌水
６．４
μ
Ｌ
。使用两步
法进行
ＰＣＲ
扩增，循环参数：
９５℃３０ｓ
；
９５℃５ｓ
，
共
４０
个循环。在
５６℃
时收集每个循环
５６℃２０ｓ
，
的荧光信号，进行熔解曲线分析。采用仪器自带软
件分析扩增曲线和熔解曲线中的荧光信号，并计算
Ｃｔ
值）平均阈值循环数（。通过
２
法计算待测基
因的相对表达量，公式：
Δ
Ｃｔ
实验组
＝
Ｃｔ
实验组待测基因
－
，
Δ
Ｃｔ
对照组
＝
Ｃｔ
对照组待测基因
－
Ｃｔ
对照组
；
Ｃｔ
实验组
。
，，
－
ΔΔ
Ｃｔ
ＧＡＰＤＨＧＡＰＤＨ
ｐｏｒｅ
隆兔抗体
公司），
ＲＩＰＡ
裂解液（上海碧云天公司），多克
（
ａｎｔｉＡＬＤＯＡ
（
ａｂ２４５４６９
）和羊抗兔
ａｎｔｉＩｇＧ
ａｂ２０５７１８
（
（
）购自美国
Ａｂｃａｍ
公司，
ＡＬＤＯＡ
小干扰
ＲＮＡｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ
，
ｓｉＲＮＡ
）和阴性对照
玛公司）
ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ
，转染试剂
ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
，
ｓｉＮＣ
）购自上海吉
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ
（美国
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司）
司），
，
公司）。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＰＣＲ
仪（美国
Ｒｏｃｈｅ
ＴｒａｎｓＢｌｏｔＳＤ
半干转膜仪（美国
ＢｉｏＲａｄ
公
Ｃｏｒｎｉｎｇ
ＢｉｏＣｏａｔ
ＴＭ
ｎｉｎｇ
公司）
公司）
国
，
，
肿瘤浸润
２４
孔板（美国
Ｃｏｒ
ＯｎｅＤｒｏｐ
超微量分光光度仪（南京五义
ＴｒｉｐｌｅＴＯＦＴＭ５６００ｐｌｕｓ
液质联用质谱仪（美
ＡＢ
的
细胞培养
Ｓｃｉｅｘ
公司）。
１．２ ＭＤＡＭＢ２３１
细胞使用含
１０％ＦＢＳ
Ｌ１５
培养基，置于
３７℃
、空气培养箱中培养。
ＢＴ５４９
置于
细胞使用含
１０％ＦＢＳ
的
ＲＰＭＩ１６４０
培养基，
３７℃
、
５％ＣＯ
２
培养箱中培养。
１
取细胞总
．３ ＲＮＡ
提取及
ＲＴＰＣＲ
反应
用
Ｔｒｉｚｏｌ
试剂提
１０
６
度（
个，使用
ＲＮＡ
，单次提取
ＲＮＡ
的细胞总数不少于
用于后续检测。按照
Ａ
２６０／２８０ｎｍ
）
ＯｎｅＤｒｏｐ
值，取
超微量分光光度仪检测吸光
Ａ
２６０／２８０ｎｍ
值在
１．９～２．１
间的样本
将总量为
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ
试剂盒说明书
１
μ
ｇＲＮＡ
逆转录为
ｃＤＮＡ
，
由上海生工公司合成。
保存。使用软件设计引物，
样本置于
－
２０℃ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ６．０
引物序列：
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
（
ＮＲ＿０４０７７３．１
）上游
物序列：
５′ＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣ３′
；下游引
为
５′ＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣ３′
，退火温度
５６℃
，扩增片段长度为
２３６ｂｐ
。
ＡＬＤＯＡ
（
；
）
ＮＭ＿
００１１２７６１７．２
上游引物序列：
５′ＴＧＴＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡ
ＧＧＴＴＴＣ３′
下游引物序列：
ＧＣＧＧＣ３′
退火温度为
５′ＴＡＧＴＡＧＣＡＡＧＴＴＣＣＴ
５６℃
，扩增片段长度为
２０３
达
［
３
］
ｂｐ
。使用
，以
，
ＧＡＰＤＨ
作为内参计算相对
ｍＲＮＡ
表
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＰＣＲ
仪及
ＴＢＧｒｅｅｎ
Ｐｒｅｍｉｘ
ＥｘＴａｑ
ＴＭ
Ⅱ
试剂盒进行实时荧光定量
ＰＣＲ
检测。
ＰＣＲ
总反应体积为
２０
μ
Ｌ
，包括：
ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘ
ΔΔ
Ｃｔ
＝
Δ
Ｃｔ
实验组
－
Δ
Ｃｔ
对照组
１
得
．４ ＲＮＡｐｕｌｌｄｏｗｎ
连接酶将单个脱硫生物素化胞苷二磷酸酯连接至
的正义链和反义链，
和质谱测定
通过体外转录获
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
并使用
Ｔ４ＲＮＡ
ＲＮＡ
正义链和反义链分别与
链的
３′
末端。将
１
μ
ｇ
生物素化的
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
记的磁珠混合，
５０
μ
Ｌ
重悬的链霉亲和素标
的裂解液中室温温育
４℃
温育过夜，再加入
ＢＴ５４９
细胞
用
１ｈ
，同时加入
液质联用质谱仪分析与
ＲＮａｓｅ
抑制剂。
ＴｒｉｐｌｅＴＯＦＴＭ５６００ｐｌｕｓ
ＲＮＡ
果：
据，
在可信度
结合的蛋白质。通过
≥
９５％
至少包含
Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ
软件分析结
１
个肽段时读取数
污染蛋白质。用于转录的
同时剔除角蛋白、
，
抗体蛋白、血清清蛋白等常见
列：
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
上游引物序
５′ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＡ
ＧＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧ３′
；下游引物序列：
５′ＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＴ３′
用于扩增反义
。
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的上游引物序列：
５′ＴＡＡ
ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡ
ＧＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＧＴ３′
；下游引物序列：
５′ＡＡＡＧＣＣＣＧ
ＧＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧ３′
。
１．５ ＲＮＡ
免疫沉淀试验测定
按照
ＭａｇｎａＲＩＰ
ＲＮＡ
结合蛋白免疫沉淀试剂盒说明书操作进行
ＲＮＡ
以测定
免疫沉淀（
ＲＮＡｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
，
ＲＩＰ
），用
ＴＮＢＣ
细胞中能与
ＡＬＤＯＡ
蛋白结合的
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
为每反应管
。用于免疫沉淀的
ＡＬＤＯＡ
抗体加入量
实时荧光定量
５
μ
ｇ
，以
ＩｇＧ
作为阴性对照。按照上述
淀中的
ＰＣＲ
和
步骤扩增
ａｎｔｉＡＬＤＯＡ
和
ＩｇＧ
沉
ＤＣＳＴ１ＡＳ１ＧＡＰＤＨ
，并以
ＩｇＧ
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
作为阴性对照。通过
２
－
ΔΔ
Ｃｔ
法计算
沉淀组中的
ａｎｔｉ
ＡＬＤＯＡ
沉淀组中
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的相对表达量。
１．６ ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
使用本课题组前期工作
［
１
备的用慢病毒作为载体的稳定干扰
］
中制
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的
ＢＴ５４９ｓｈ
达
细胞及其阴性对照
ＢＴ５４９ＮＣ
，稳定过表
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
。将细胞分别接种于
的
ＭＤＡ２３１ｅｘｐ
细胞及其阴性对照
ＭＤＡ２３１ＮＣ６
孔细胞培养板
·
８９６
·
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉ
，
Ｄｅｃ．２０２０
，
Ｖｏｌ．３８
，
Ｎｏ．１２
中，当细胞融合度达
９０％
、单孔细胞总数不少于
１０
性。以
Ｐ＜０．０５
为差异有统计学意义。
个时，收集细胞，用预冷的
ＰＢＳ
洗涤并用
ＲＩＰＡ
缓冲
２
结果
液裂解。使用标准
Ｂｒａｄｆｏｒｄ
试剂盒测定细胞裂解液
中的蛋白质水平，用
１０％ＳＤＳＰＡＧＥ
电泳分离总蛋
２．１ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的靶蛋白分析
通过
ＲＮＡｐｕｌｌ
共计有
２５
种蛋白质能特异性与
ＤＣＳＴ１
白质，使用
ＴｒａｎｓＢｌｏｔＳＤ
半干转膜仪调节稳定电流
ｄｏｗｎ
测定，
转膜
１２０ｍｉｎ
，将蛋白质转移至聚偏二氟
ＡＳ１
正义链结合。将这
２５
种蛋白质与本课题组前
为
２００ｍＡ
，
乙烯膜，用
ＴＢＳＴ
充分洗涤。随后用含
５％ＢＳＡ
的
期检测的三阴性乳腺癌组织
ＬｎｃＲＮＡ
芯片数据中显
室温摇床振荡温育
２ｈ
。再次用
ＴＢＳＴ
著上调表达的
２０９２
种基因
［］
进行整合（
ＧｅｎｅＥｘ
ＴＢＳＴ
封闭，
，结果发现磷酸三糖
充分洗涤后，加入多克隆兔抗体
ａｎｔｉＡＬＤＯＡ
（
１∶
ｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓＧＳＥ１１５２７５
）
、
ＡＬ
与膜在
４℃
摇床温育过夜。加入辣根过
异构酶
１
（
ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅＩｓｏｍｅｒａｓｅ１
，
ＴＰＩ１
）
１０００
稀释）
同时存在于
ｃｏｒｎｅｏｄｅｓｍｏｓｉｎ
，
ＣＤＳＮ
）
ＤＯＡ
和角蛋白（
氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体
ａｎｔｉＩｇＧ
（
１∶２０００
稀
。
ＴＰＩ１
、
ＡＬＤＯＡ
、
ＣＤＳＮ
蛋白分
释）与膜在室温摇床振荡反应
２ｈ
。用
ＧＡＰＤＨ
作为
这
２
项检测中（图
１
）
蛋白质表达的内参照。使用
ＳＹＮＧＥＮＥＧ
：
ＢＯＸ
子中与
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合的序列分别为
ＳＮＶＳ
ＡＬＡＮＳＬＡＣＱＧＫ
和
ＳＮＶＳＤＡＶＡＱＳＴＲ
。
英国
Ｓｙｎｇｅｎｅ
公司）采集图像，并使
ＤＡＶＡＱＳＴＲ
、
ｃｈｅｍｉＸＲ５
系统（
用
ＧｅｌＰｒｏ３２
软件读取并计算
ＡＬＤＯＡ
和
ＧＡＰＤＨ
的
蛋白质灰度值。
１．７
细胞侵袭能力测定
预包被基质胶的
Ｃｏｒｎｉ
该小室由
ｎｇＢｉｏＣｏａｔ
肿瘤浸润
２４
孔细胞培养板［
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
膜滤器（孔径为
８
μ
ｍ
）插入
２４
孔细胞培养
板中组成］，用不含血清的培养基将待测细胞密度
图
１
韦恩图分析乳腺癌组织芯片检测结果和
ｐｕｌｌｄｏｗｎ
调节至
２．５
×
１０ｍＬ
，取
２００
μ
Ｌ
细胞悬液加入小室上
蛋白的质谱检测结果
室中，并将
５００
μ
Ｌ
含
１０％ＦＢＳ
的培养基加入小室下
２．２ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
表达的相关性分析
通
室中，置于
３７℃
细胞培养箱中温育
１０ｈ
。使用棉签
过
ＧＥＰＩＡ２
分析癌症基因组图集（
ＴｈｅＣａｎｃｅｒ
擦去小室膜上层的基质胶和未穿过膜的细胞。用
ＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓ
，中的乳腺癌阵列结果发现，
ＴＣＧＡ
）
通过
ＡＬＤＯＡ
在乳腺癌中显著上调表达，
４％
多聚甲醛固定膜下层细胞后用结晶紫染色，
ＴＰＩ１
、
ＣＤＳＮ
在乳
倒置显微镜观察比较穿过基质胶与膜小孔的细胞。
腺癌组织和正常组织中的表达差异无统计学意义
１．８
统计学分析
采用
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７
统计软件
图
２
）。
Ｐｅａｒｓｏｎ
相关性分析发现，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
处理数据，所有实验数据至少重复
３
次。配对
ｔ
检
（
Ｐ＜０．０１
）表达量呈正相关（
ｒ
＝
０．１９
，，而与
验用于
ＲＴＰＣＲ
中实验组与对照组差异的比较。单
ＡＬＤＯＡ
（、
ｒ
＝
０．０１３
，
Ｐ
＝
０．６５
）
ＣＤＳＮ
（
ｒ
＝
０．０４５
，
Ｐ
＝
０．１２
）
尾
ＡＮＯＶＡ
用于
ＴＣＧＡ
乳腺癌阵列中肿瘤组织与正
ＴＰＩ１
常组织的基因表达差异的比较。
Ｐｅａｒｓｏｎ
相关性系
的表达量均无相关性。
数用于分析
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与靶蛋白表达之间的相关
６
１
ＴＭ
５
注：肿瘤组织（红色）；正常组织（灰色）；每百万映射读取的转录本；
Ｔ
，
Ｎ
，
ＴＰＭ
，
Ｐ＜０．０１
。
，
ＴＰＩ１
和
ＣＤＳＮ
在癌组织和正常组织中的表达
图
２
箱形图分析
ＡＬＤＯＡ
、
２．３ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
结合并影响其表达
ＲＴＰＣＲ
检测发现，与阴性对照组（
１００％
）相比，
·
８９７
·
ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ
的相对表达量在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺失时
ＡＬＤＯＡ０．０９
）（图
３Ａ
）。
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测结果表明，
Ｐ＜０．０５
）下调至
５８．８％
（
ｔ
＝
１５．６
，，而在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
在蛋白质水平的变化趋势与
ｍＲＮＡ
水平相同（图
ｔ
＝
３５．６
，
Ｐ＜０．０５
）
ＴＰＩｍＲ３Ｂ
）过表达时上调至
３６８．８％
（；。进一步用剩余的拉下蛋白液进行
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
鉴定，发现只有
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
正义链拉下的蛋白液中
ＮＡ
在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺失时下调至
９８．０％
（
ｔ
＝
１．１０
，
Ｐ
＝
０．３３
），而在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
过表达时上调至
１１９．１％
检测到
ＡＬＤＯＡ
（图
３Ｃ
）。
ＲＩＰ
结合
ＲＴＰＣＲ
实验表
（；明，在
ＡＬＤＯＡ
蛋白的
ＲＮＡ
沉淀物中检出的
ｔ
＝
２．４６
，
Ｐ
＝
０．０７
）
ＣＤＳＮｍＲＮＡ
在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺
失时上调至
１１２．２％
（
ｔ
＝
２．２１
，
Ｐ
＝
０．１０
），而在
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
表达量是阴性对照组的
４５５．７
倍（
ｔ
＝
。
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
过表达时上调至
１３２．１％
（
ｔ
＝
２．２３
，
Ｐ
＝
Ｐ＜０．０５
）
５１．５
，
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉＤｅｃ．２０２０Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１２
，，，
Ａ
，
ＲＴＰＣＲ
检测
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
缺失和过表达时
ＴＰＩ１
、
ＡＬＤＯＡ
和
ＣＤＳＮｍＲＮＡ
的变化，
Ｐ＜０．０５
；
Ｂ
，
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
敲减和注：
，
Ｃ
，
ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
检测
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
的正义链和反义链拉下蛋白液中的
ＡＬＤＯＡ
。过表达时
ＡＬＤＯＡ
蛋白质水平的变化；
图
３ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
与
ＡＬＤＯＡ
结合并影响其表达
２．４ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
促进乳腺癌细胞的侵
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
表达并未受到明显影响（
ｔ
＝
１．９１
，
Ｐ
＝
袭
ＲＴＰＣＲ
结果表明，图
４Ａ
）。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
侵袭试验表明，干扰
ＡＬＤＯＡｓｉＲＮＡ
能有效干扰
０．１３
）（
将
ＡＬＤＯＡＡＬＤＯＡ
的表达抑制了
ＭＤＡ２３１ｅｘｐ
细胞的侵袭
ＭＤＡＭＢ２３１
细胞中的
ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ
，
，而（图
４Ｂ
）。
ｍＲＮＡ
下调至对照组的
１０．８％
（
ｔ
＝
２９．８
，
Ｐ＜０．０５
）
×
２００
）
Ａ
，
ＲＴＰＣＲ
检测
ＡＬＤＯＡｓｉＲＮＡ
的干扰效率，
Ｐ＜０．０５
；
Ｂ
，
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ
侵袭试验检测
ＡＬＤＯＡ
对
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
侵袭能力的影响（注：。
，
图
４ ＤＣＳＴ１ＡＳ１
结合
ＡＬＤＯＡ
促进乳腺癌的侵袭
１２
３
讨论
性
［］
。除了乳腺癌，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
作为促癌因子发
挥作用也在其他类型的癌症中得到了证实。有学者
ＬｎｃＲＮＡ
的失调是在各种癌症中观察到的特征
指出，
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
在子宫内膜癌中表达上调并通过
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
标志之一
［］
。本课题组前期研究发现，
影响
Ｎｏｔｃｈ１
蛋白促进癌症侵袭和转移
［］
。
ＤＣＳＴ１
在
ＴＮＢＣ
中上调表达且与癌组织的远端转移（
Ｐ
＝
ＡＳ１
参与调节
ＡＫＴ／ｍＴＯＲ
信号通路，促进肝癌细胞
及病理组织学（
Ｐ
＝
０．０２６
）分级相关；
０．０２４
）
ＤＣＳＴ１
［］
。
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
可以通过竞争的增殖、转移和自噬
ＡＳ１
能够促进乳腺癌细胞的增殖、转移和化疗耐药
４
５
６
·
８９８
·
临床检验杂志
２０２０
年
１２
月第
３８
卷第
１２
期
ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＬａｂＳｃｉ
，
Ｄｅｃ．２０２０
，
Ｖｏｌ．３８
，
Ｎｏ．１２
内源性
ｍｉＲ６０５３ｐ
调节胃癌细胞的增殖、迁移、侵
］，，（）：
袭和凋亡
［］
。在本研究中，笔者提出
ＤＣＳＴ１ＡＳ１
能
［］
［
，，，
够与
ＡＬＤＯＡ
直接结合，通过调控
ＡＬＤＯＡ
的表达以
促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭。
［］
ＡＬＤＯＡ
是关键的糖酵解酶，在包括乳腺癌在内
，，：
在食管鳞状细胞
的多种类型的癌症中呈高表达，被认为是独立的癌
［］王晓飞，崔渊博，孙晓燕，等血浆
］临床检验杂志，，（）：
症临床预后标志物
［］
。
ＡＬＤＯＡ
在促进癌症转移方
［］
癌中的表达及意义［
，，，
面的功能得到了广泛的研究；有学者证实
ＡＬＤＯＡ
：［］，
能够促进上皮间质转化（
ＥＭＴ
），从而促进宫颈癌恶
，：
［］
性进程；
ＡＬＤＯＡ
的过表达增加了肺癌细胞系在体
［］，，，
ｃａｎｃｅｒｂｙｆｏｒｍｉｎｇａｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｌｏｏｐｗｉｔｈｍｉＲ８７３５ｐａｎｄ
ＭＹＣＪ．ＪＣａｎｃｅｒ２０２０１１２３１１３２３．
７
２ＴａｎｇＬＣｈｅｎＹＣｈｅｎＨｅｔａｌ．ＤＣＳＴ１ＡＳ１ｐｒｏｍｏｔｅｓＴＧＦ
β
ｉｎ
ｄｕｃｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ
版权声明：本文标题：LncRNA DCST1-AS1结合ALDOA促进三阴性乳腺癌细胞的侵袭 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://www.roclinux.cn/b/1710937655a580432.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
更多相关文章
基质金属蛋白酶-2和9在混合性结缔组织病单个核细胞中的表达
年月日发(作者：安装包)・・山西医药杂志年月第卷第期下半月，，．，．基质金属蛋白酶一和在混合性结缔组织病单个核细胞中的表达晋中市第二人民医院（）化红霞王香弟李锦艳【摘要】目的探讨基质金属蛋白酶（）一和与混合性结缔组织病（）的关系。方法采用印
结肠癌中MMP-2和MMP-9蛋白表达与微血管计数的关系
年月日发(作者：汇编指令条)维普资讯．．安徽医药；（）结肠癌中．和一蛋白表达与微血管计数的关系张明林，许建明，梅俏，鲍峻峻）（．安徽省马鞍山市人民医院，安徽马鞍山；．安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽合肥摘要：目的探讨－、－蛋白在结肠肿
基质金属蛋白酶MMP-2、-9表达与卵巢肿瘤细胞侵袭能力的研究
年月日发(作者：易语言)维普资讯现代诊断与治疗（）・・・论著・基质金属蛋白酶．、－表达与卵巢肿瘤细胞侵袭能力的研究袁令芹，张友忠，刘文君（山东大学齐鲁医院．妇科；．病理科，山东济南）－，－－．，－，－（．；．—［，，，．，）：－－．－－・．
基质金属蛋白酶
年月日发(作者：)基质金属蛋白酶细胞外基质和基底膜重塑是癌细胞侵袭转移过程中的关键环节，需借助于蛋白降解酶的表达和激活。基质蛋白酶主要有以下数种：丝氨酸蛋白酶类，包括血浆酶原激活剂；半胱氨酸蛋白酶类，包括组织蛋白酶在内的溶酶体酶；金属蛋白酶
mmp2 基质金属蛋白酶 信号通路
年月日发(作者：框架教程)基质金属蛋白酶信号通路在生物学中，基质金属蛋白酶信号通路是一个备受关注的课题。基质金属蛋白酶（）是一类能够降解细胞外基质的酶，包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和凝血蛋白的一类蛋白酶，是调控细胞外基质成分的关键因素。在这个
生工RNA提取试剂盒
年月日发(作者：个人简历模板代码)生工提取试剂盒-柱式总抽提试剂盒产品编号：包装规格：次次试剂盒组成组分，次，次纯化套件（吸附柱收集管）套套-操作手册份份保存方法及注意事项试剂盒于常温运输，试剂请按照要求分别保存。有效期见包装。是强腐蚀性物
EASYspin 组织 细胞RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
年月日发(作者：实训心得体会人力资源)杭州昊鑫生物科技股份有限公司:组织细胞快速提取试剂盒目录号：目录编号适用范围：适用于快速提取各种细胞组织总试剂盒组成、储存、稳定性：保存室温室温室温室温室温室温包装单位次试剂盒组成裂解液去蛋白液漂洗液-
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody n7200 N7210 使用说明书
年月日发(作者：微信开发者工具)中文说明书-适用产品目录号：、原英文技术手册版-所有技术文献的英文原版均可在本。如果您在使用该试剂盒时有任何问题，请与获得。请访问该网址以确定您使用的说明书是否为最新版电子邮箱：***************
cleavage在生物医学的意思
年月日发(作者：可以做前端吗)在生物医学中的意义是核酸酶在或分子上切割出一条或多条链的过程。在生物医学领域中，具有非常重要的地位，涉及到许多重要的生物学过程，如基因表达、复制、编辑等。首先，是基因表达过程中必不可少的一部分。在基因表达中，会
tev蛋白酶的优化表达及功能分析
年月日发(作者：什么意思)().,.,..:.,,..-,.()%,--%...,,-..(–)..(–)-.()..(),(–).(–)...-----..()..-.,...(),.,-.:，，，，目录摘要...............
剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响
年月日发(作者：罗马对穆里尼奥)剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响蛋白免疫印迹()是当前蛋白分析的一种常规技术，它结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，用于检测样品中特异蛋白存在与否、细胞中特异蛋白的半定量分析和蛋白质
大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究
年月日发(作者：拍短视频入门基础)大鲵虹彩病毒-丙内酯灭活方法的研究孙建滨;曾令兵;张辉;孟彦;徐进;周勇;王芳;李瑞伟;刘秋凤【摘要】为探讨-丙内酯(-,)灭活大鲵虹彩病毒(,)的最适条件,研究了对的灭活方法.采用终浓度分别为.％、.％、
常见蛋白质标签
年月日发(作者：在线生成工具)常见蛋白质标签总结--:.,..一、氨基酸标签（含小肽标签）..组氨酸标签（）一般为个组氨酸，用（）亲和层析纯化：--，：(，禽流感病毒血凝素)，..--，：-，..--,--，：，链霉亲合素结合肽，()，更多
Python安全实践——PythonHacking第章课件 (一)
年月日发(作者：下载安装)安全实践——第章课件(一)是当前最流行的编程语言之一。在网络安全领域，也得到了广泛的应用。第章课件介绍了在网络安全实践中的应用，为网络安全领域的从业人员提供了有益的指导和参考。一、在网络安全领域的应用作为一种高级语
植物学练习题
年月日发(作者：世界著名油画)植物细胞与组织作业一.简答题植物细胞的初生壁和次生壁有什么区别？初生壁的主要成分是纤维素、半纤维素和果胶，一般较薄，质地柔软，具较好的通透性和可塑性。所有细胞都具有初生壁。初生壁存在于所有活的植物细胞。初生壁位
编译原理 试题及答案
年月日发(作者：批量)课程测试试题（卷）、命题院（部）：数学与计算机科学学院、课程名称：编译原理、测试学期：－学年度第学期、测试对象：数计、国交学院计科专业级、、国交班、问卷页数（）：页、答卷页数（）：页、考试方式：闭卷（开卷、闭卷或课程小
程序法知识点总结
年月日发(作者：面试个经典题)程序法知识点总结一、计算机基础知识.计算机体系结构：硬件单位、主要组成部分、各个部分的功能和工作原理等。.数据表示：二进制、十进制、十六进制等进制转换，数据的存储表示和编码方式。.计算机网络：网络结构、协议、传
2018年全球十大新兴技术：细胞植入人体、营养人造肉……你想试试吗？
来源：光明日报 摘要：在不久的将来，技术革新将如何改变我们的生活？人工智能将大幅提升新药物和新材料的开发速度；新型诊断工具将打造更
linux下，搜狗输入法如何添加细胞词库
搜狗输入法提供了非常丰富的细胞词库，平常可以在搜狗细胞词库官网上下载自己需要的词库，并导入到搜狗输入法中。如果有需要，我们也可以自己制作词库，上传到搜狗
从源头入手：快速定位并修复你的Adobe Flash Player故障
快速体验打开 输入框内输入如下内容： 创建一个DelphiPascal程序调试助手，能够自动分析Runtime Error 217错误。当用户输入错误地址00415f3d时，系统应：1. 解析错误类型和
发表评论