运用基因组和EST数据库进行电子克隆分离杨树功能基因的策略_林元震

分子植物育种，

２００７年，第５卷，第４期，第５８３－５８７页

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００７，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．４，５８３－５８７

新思路、新技术、新方法

ＮｏｖｅｌＴｈｉｎｋｉｎｇ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

运用基因组和ＥＳＴ数据库进行电子克隆分离杨树功能基因的策略

林元震

１，２

张志毅

１＊

林善枝

１

张谦

１

刘纯鑫

２

郭海

３

１北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室，北京，１０００８３；２华南农业大学林学院，广州，５１０６４２；３水利部水土保持植物中心，北京，

１０００３８

＊

通讯作者，ｚｈａｎｇｚｙ＠ｂｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

杨树是重要的造林绿化树种，也是主要的工业用材树种，还是高大林木的模式树种。进行杨树功能

基因的挖掘、克隆和功能的研究，是当前杨树基因组学的首要任务之一，不仅可为杨树品种改良和基因资源

的有效利用奠定基础，而且对探讨林木的生理及遗传特性分子机制也具有重要的理论意义。电子克隆是近年

摘要

具有成本低、速度快、技术要求低和针对性强

来伴随着基因组计划和

ＥＳＴ计划发展起来的基因克隆新方法，

等优点。丰富的杨树ＥＳＴ数据和公布的杨树基因组序列框架图，使得利用电子克隆技术开展杨树功能基因

的分离和鉴定已经成为可能。本文阐述了电子克隆分离杨树功能基因的基本方法、相关的生物信息资源，并

讨论了电子克隆技术存在的问题和未来发展。

关键词

杨树，功能基因，基因组和ＥＳＴ数据库，电子克隆

Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒ

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

Ｃｌｏｎｉｎｇ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｅｓＢａｓｅｄｏｎ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＥＳＴＤａｔａｂａｓｅ

ＬｉｎＹｕａｎｚｈｅｎ

１，２

ＺｈａｎｇＺｈｉｙｉ

１＊

ＬｉｎＳｈａｎｚｈｉ

１

ＺｈａｎｇＱｉａｎ

１

ＬｉｕＣｈｕｎｘｉｎ

２

ＧｕｏＨａｉ

３

１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＦｏｒｅｓｔＴｒｅｅｓａｎｄＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔｓ，ＭＯＥ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００８３；２Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ

Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０６４２；３ＰｌａｎｔＭａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒＳｏｉｌａｎｄＷａｔｅｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＷａｔｅｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，

Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００３８

＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｚｈａｎｇｚｙ＠ｂｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｐｏｐｌａｒｓａｒｅｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓｆｏｒｆｏｒｅｓｔａｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｅｓｃｅｎｃｅ，ａｓｗｅｌｌａｓｆｏｒｔｈｅｐａｐｅｒ－ｍａｋｉｎｇ

ａｎｄｔｉｍｂｅｒｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｔｗｏｕｌｄｂｅａｃｃｅｐｔｅｄａｓａｍｏｄｅｌｔｒｅｅｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｔｒｅｅｓｃｉｅｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｌａｎｔ

ｇｅｎｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｒｅｃｅｎｔｄｅｃａｄｅ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｆｒｏｍｐｏｐｌａｒｓｉｓｂｅｃｏｍｉｎｇ

ｏｎｅｏｆｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐａｌｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓｏｆ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ｇｅｎｏｍｅｐｒｏｇｒａｍ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｈｅｌｐｕｓｔｏｍａｋｅｃｌｅａｒｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅ－

ｎｅｔｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｐｏｐｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｅ－

ｓｅａｒｃｈ．

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇｉｓａｋｉｎｄｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｕｓ－

ｉｎｇｇｅｎｏｍｅａｎｄＥＳＴｄａｔａｂａｓｅ，Ｔｈｅｒｅａｒｅｌｏｔｓｏｆａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆ

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｕｃｈａｓｌｏｗｃｏｓｔ，ｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，

ａｎｄｅａｓｙｏｐｅｒａｔｉｏｎｃｏｍｐａｒｅｄｔｏ

ｉｎｌａｂ

ｃｌｏｎｉｎｇ．ＷｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｍｅｎｔｏｆＥＳＴｄａｔａａｎｄａｃｃｏｍｐｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｉｔｗｏｕｌｄｂｅｃｏｍｅｐｏｓｓｉｂｌｅａｎｄｆｅａｓｉｂｌｅｔｏｉｓｏｌａｔｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｆｒｏｍｐｏｐｌａｒ

ｂｙ

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｗｅｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｒｅｌａｔｅｄｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｒｅ－

ｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄａｌｓｏｄｉｃｕｓｓｅｄｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆ

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇ．

ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｏｐｕｌｕｓ

，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅ，ＧｅｎｏｍｅａｎｄＥＳＴｄａｔａｂａｓｅ，

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇ

杨树是世界上分布最广、适应性最强的树种，主

要分布在北半球温带和寒温带（北纬２２

ｏ

￣７０

ｏ

）。杨树

是许多国家的重要造林绿化树种，也是生态防护林

的主要树种，不仅是用材林中纸浆材的好原料，也适

合于作胶合板材和包装箱材，在工业上起着非常重

要的作用。杨树具有速生优质，轮伐期短，适应性强，

基金项目：本研究由国家自然科学基金项目（３０２７１０９３）、国家十一五科技支撑计划专题（２００６ＢＡＤ０１Ａ１５－２）资助。

５８４

分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

繁殖容易，用途广泛等特点，越来越引起人们的重

视。另外，杨树生长周期短，离体操作容易，基因组相

对较小，被喻为林木的“拟南芥”（Ｔａｙｌｏｒ，２００２）。因

此，挖掘和克隆杨树功能基因不仅是利用基因工程

技术进行杨树品种改良、有效利用基因资源的基础，

同时，也对研究林木的生理及遗传特性分子机制具

有重要的理论意义。基因克隆的传统方法是采用差

减杂交、原位杂交筛选

ｃＤＮＡ文库、ｍＲＮＡ差异显示

（ＤＤＲＴ）或ｃＤＮＡ末端快速扩增（ＲＡＣＥ），这些方法的

特点是费时费力、花费高、成功率低，所以未得到广

泛运用。电子克隆

（

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇ）是近年来伴随着

基因组计划和ＥＳＴ计划发展起来的基因克隆新方

法，其主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，

借助电子计算机的巨大运算能力，通过ＥＳＴ或基因

组的序列组装和拼接，再利用

ＲＴ－ＰＣＲ快速获得功

能基因，该方法具有成本低、速度快、技术要求低和

针对性强等优点（黄骥等，２００２ｂ）。

随着人类、拟南芥、水稻等基因组计划的实施，

已有研究人员利用电子克隆的方法从人类、水稻等

中克隆了一些功能基因。目前在

ＧｅｎＢａｎｋ中杨树

ＥＳＴ数据非常丰富，而且ＥＳＴ数目每天还在高速增

加。

２００３年底，美国ＪＧＩ公司公布了杨树基因组的序

列框架图，因此，利用生物信息学技术全面开展杨树

功能基因的分离和鉴定已经成为可能，而且发现新

的基因及其功能也是当前杨树基因组学的首要任务

之一。本文阐述了电子克隆分离杨树功能基因的基

本方法和相关的生物信息资源，并讨论了电子克隆

技术存在的问题和未来发展。

索水稻ＥＳＴ库，经过拼接获得了１个８８６ｂｐ的全长

ｃＤＮＡ序列，通过ＲＴ－ＰＣＲ成功分离了该基因的完整

ｃＤＮＡ克隆，可能编码一个新的锌指蛋白基因。他们

还以玉米全长６－磷酸葡萄糖酸脱氢酶ｃＤＮＡ为查询

探针，通过电子克隆获得了１．８ｋｂ左右的ｃＤＮＡ序

列，进一步用

ＲＴ－ＰＣＲ克隆了水稻的６－磷酸葡萄糖

目前还未见有直接利酸脱氢酶基因（黄骥等，２００２ａ）。

用杨树

ＥＳＴ序列拼接获得杨树完整ｃＤＮＡ的报道，

但有采用其他物种ｃＤＮＡ或者ＥＳＴ作为查询探针

获得杨树同源基因。张春玲等

（２００６）以矮牵牛

Ｐｈ－

利用杨树ＥＳＴ数据库

ＥＸＰ１

ｃＤＮＡ序列为信息探针，

和毛果杨基因组测序结果，通过序列的拼接设计合

成了基因特异引物，从毛白杨中扩增出一个长为

１．０

ｋｂ的全长ｃＤＮＡ，可能与形成层细胞分化相关。我们

也利用拟南芥的相关

ＥＳＴ搜索杨树ＥＳＴ数据库（林

元震，２００６），经拼接组装成全长ｃＤＮＡ序列，并运用

ＲＴ－ＰＣＲ从甜杨中分离到一些与抗冻相关的功能基

因，比如

ＳＯＤ（ＧｅｎＢａｎｋ登记号：ＤＱ４８１２３１）、ＩＣＥ１

（ＧｅｎＢａｎｋ登记号：ＤＱ４８１２３６）、ＬＥＡ５（ＧｅｎＢａｎｋ登记

号：

ＤＱ４８７１０１）、ＣＢＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ登记号：ＤＱ４８７１０３）

和ＡＢＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ登记号：ＤＱ４８７１００）。

拼接分离目的基因

１．２

基因组预测

、

１

电子克隆分离杨树功能基因的方法

１．１ＥＳＴ

拼接分离目的基因

目前电子克隆最常用的方法是利用ＥＳＴ信息进

行功能基因的分离，大致流程如下：选择目的杨树

ＥＳＴ或者其他物种尤其是亲缘关系较近的物种全长

ｃＤＮＡ或ＥＳＴ作为查询探针，通过在线Ｂｌａｓｔ搜索杨

树ｄｂＥＳＴ数据库，找到部分重叠的ＥＳＴ并进行拼

接，再以拼接好的

ＥＳＴ重叠群（ＥＳＴｃｏｎｔｉｇ）作为新的

查询探针，继续搜索ｄｂＥＳＴ库，直到没有新的ＥＳＴ

可供拼接为止，最后根据拼接好的完整序列设计

ＰＣＲ引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得目的ｃＤＮＡ片段并克

隆、测序验证

（黄骥等，２００２ｂ）。

利用ＥＳＴ进行电子克隆在植物功能基因克隆上

的运用也是刚刚起步。黄骥等（２００２ｃ）以水稻盐胁迫

ｃＤＮＡ文库１个５００ｂｐ的ＥＳＴＳ１２１为信息探针搜

２００２年２月，开始实施毛果杨基因组的测序计

划。至

２００３年底，美国ＪＧＩ公司宣布毛果杨基因组序

列草图已经完成，并将测序结果无偿地公布在Ｉｎｔｅｒｎｅｔ

上（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｏｐｔｒ１／Ｐｏｐｔｒ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ），

全世界的研究人员都可免费下载、公开使用，这必

将加速杨树功能基因的电子克隆。基因组信息不受

植物发育时期或特殊环境条件的影响，因此这是利

用基因组信息进行电子克隆的最大优点。一般流程

如下：用来源于任何时期或组织的杨树和其他物种

的

ＥＳＴ、全长ｃＤＮＡ序列或氨基酸序列作为信息探

针，搜索毛果杨基因组序列，通过人工拼接或相应

的生物信息学软件预测，得到该基因完整的开放读

码框

（ＯＲＦ），根据拼接的序列结果设计ＰＣＲ引物，进

一步用ＲＴ－ＰＣＲ获得目的基因的ｃＤＮＡ并克隆、测

序验证。

我们利用已分离到的甜杨葡萄糖－

６－磷酸脱氢

酶

ｃＤＮＡ片段为探针（林元震等，２００６），搜索毛果杨

基因组数据库，结果找到２个与之高度同源的毛果

杨相应基因组序列，通过Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ网站的ＦＧＥ－

ＮＥＳＨ

预测编码框，利用ＲＴ－ＰＣＲ从甜杨中首次克隆

到了杨树葡萄糖－６－磷酸脱氢酶的全长ｃＤＮＡ，命名

为

ＰｓＧ６ＰＤＨ

（ＧｅｎＢａｎｋ登记号：ＡＹ４４５９１７），经分析

略策的因基能功树杨离分隆克子电行进库据数ＥＳＴ和组因基用运

ＤａｔａｂａｓｅＥＳＴａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｅＧｅｎｏｍｅ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ｏｎＢａｓｅｄＧｅｎｅｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

Ｃｌｏｎｉｎｇ

ｓｉｌｉｃｏｉｎ

ｆｏｒＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ

５８５

表明该基因编码胞质Ｇ６ＰＤＨ，是磷酸戊糖途径的限

速酶。另外，我们还进一步预测和分析了毛果杨葡萄

糖－６－磷酸脱氢酶基因的可能启动子区域，采用

ＰＣＲ从甜杨中分离了一个启动子，序列分析表明含

有ＴＡＴＡｂｏｘ、ＣＡＡＴｂｏｘ基本元件以及ＡＢＡ应答

元件、抗寒元件等多个逆境胁迫诱导元件。

１．３

结合利用

ＥＳＴ

数据库和基因组信息

根据ＥＳＴ数据库或基因组信息进行电子克隆，

有时会存在一定的局限性和误差性。从ＥＳＴ数据库

或ｃＤＮＡ编码的蛋白序列去搜索毛果杨基因组，进

行外显子预测，然后对引物设计区域搜索ＥＳＴ一致

性序列作为引物，最后利用ＲＴ－ＰＣＲ扩增进行目的

基因克隆及序列鉴定。这样可在较大程度上减少

ＥＳＴ拼接的工作量或者不完整性以及引物设计的简

并性问题。

２

相关生物信息资源

进行电子克隆时，比较关键的因素有ＥＳＴ数据

库、基因组信息和相关的生物信息学软件，这三者的

方面来看，ＥＳＴ数据虽然直接代表的是表达序列，在

有机结合能极大地提高该技术的可行性、准确性和

电子克隆的拼接中占有非常重要的地位，但有时某

快速性。表１概括了目前ＮＣＢＩ和ＰｏｐｕｌｕｓＤＢ收录

些ＥＳＴ数据缺乏而无法拼接出完整的ｃＤＮＡ序列；

杨树ＥＳＴ情况，可见前者不但量大，而且更新快，后

对于基因组信息，因为外显子预测大多采用生物信

息学软件，难免会存在一定的错误。因此，进行电子

克隆时应该结合ＥＳＴ数据库和基因组信息两个方面

综合考虑。另外，由于不同物种的功能基因存在同源

性，即基因序列不完全一致，这样进行ＥＳＴ拼接时或

基因组序列外显子拼接时，要注意简并性问题，尤其

是引物设计区域，要充分利用ＥＳＴ信息来寻找一致

序列作为特异引物设计的模板。一般策略是对于任

何一个目的序列先进行ＥＳＴ搜索和拼接，无法继续

拼接后再进行基因组比较和外显子预测，以判断

ＥＳＴ拼接的完整性。

另外，相对而言，蛋白质的序列要比核酸序列的

保守性更高，因此，当以其它物种ＥＳＴ或ｃＤＮＡ为

信息探针，我们采用的策略（图１）是利用该物种ＥＳＴ

表１杨树ＥＳＴ数据库

Ｔａｂｌｅ１

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ＥＳＴｄａｔａｂａｓｅ

ＮＣＢＩ

Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ

Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ×Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ

Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ×Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ

Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ

Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ×Ｐ．ｎｉｇｒａ

Ｐｏｐｕｌｕｓｎｉｇｒａ

Ｐｏｐｕｌｕｓｄｅｌｔｏｉｄｅｓ

Ｐｏｐｕｌｕｓｅｕｐｈｒａｔｉｃａ

Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

×Ｐａｎｅｓｃｅｎｓ

Ｐｏｐｕｌｕｓｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ

Ｐｏｐｕｌｕｓａｌｂａ×Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａｖａｒ．ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ

Ｐｏｐｕｌｕｓｆｒｅｍｏｎｔｉｉ×Ｐ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ

Ｐｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｉｇｌａｎｄｕｌｏｓａ

Ｐｏｐｕｌｕｓａｌｂａ

×Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ

ＰｏｐｕｌｕｓＤＢ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

１２４８１

数量

Ａｍｏｕｎｔ

８９９４３

７６１６０

５３１７３

３７３１３

２０１３０

１５２５７

１４６６１

１３９０５

１２８１３

１０４４６

１０１５７

７５９５

５４１０

１６５０

５８５

图１利用杨树ＥＳＴ和基因组数据库进行电子克隆的策略

Ｆｉｇｕｒｅ１Ｓｔｒａｔｅｇｙｏｆ

ｉｎｓｉｌｉｃｏ

ｃｌｏｎｉｎｇｂｙ

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ＥＳＴａｎｄｇｅｎｏｍｅ

ｄａｔａｂａｓｅ

者则不仅量小，而且更新慢。但两者可结合使用，一

般策略是当信息探针为非杨树ＥＳＴ时，先到杨树专

门ＥＳＴ数据库ＰｏｐｕｌｕｓＤＢ搜索杨树ＥＳＴ，以得到的

杨树ＥＳＴ作为种子ＥＳＴ，再在ＮＣＢＩ上继续搜索其

他杨树ＥＳＴ，这样减少搜索工作量。表２列出了与电

子克隆相关且应用比较广泛的生物信息学资源。其

中，ＥＳＴ拼接和基因结构分析的软件，大大加快了电

子克隆的速度。比如Ｔｉｇｅｍ的ＥＳＴ组装机器，用户输

入目的ＥＳＴ序列，计算机程序自动搜索ＥＳＴ数据库

并构建ＥＳＴ重叠群，循环搜索，整合成尽可能长的

ＥＳＴ序列。当电子克隆采用基因组序列信息时，基因

５８６

分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

表２常用的生物信息学网址

Ｔａｂｌｅ２Ｕｓｅｆｕｌｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｗｅｂｓｉｔｅｓ

名称

Ｎａｍｅ

Ｐｏｐｕｌｕｓｇｅｎｏｍｅ

ＰｏｐｕｌｕｓＤＢ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ＮＣＢＩ

Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ

Ｔｉｇｅｍ

Ｐｌａｃｅ

ＰｌａｎｔＣａｒｅ

网址

ＵＲＬ

ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｏｐｔｒ１／Ｐｏｐｔｒ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ

ｈｔｔｐ：／／ｐｏｐｐｅｌ．ｆｙｓｂｏｔ．ｕｍｕ．ｓｅ／

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｅｍ．ｉｔ／ＥＳＴｍａｃｈｉｎｅ．ｈｔｍｌ

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／

ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ／

说明

Ｎｏｔｅ

杨树基因组数据库

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ｇｅｎｏｍｅｄａｔａｂａｓｅ

杨树ＥＳＴ数据库

Ｐｏｐｕｌｕｓ

ＥＳＴｄａｔａｂａｓｅ

拟南芥数据库

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｄａｔａｂａｓｅ

ＥＳＴ数据，Ｂｌａｓｔ等分析

ＥＳＴｄａｔａｂａｓｅａｎｄＢｌａｓｔａｎａｌｙｓｉｓ

各种生物信息预测

Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ

ＥＳＴ组装机器

ＥＳＴａｓｓｅｍｂｌｉｎｇｍａｃｈｉｎｅ

启动子预测

Ｐｒｏｍｏｔｅｒｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ

启动子预测

Ｐｒｏｍｏｔｅｒｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ

结构分析的软件就比较关键，一般包括外显子预测

和启动子预测。由于不同物种在外显子剪接、启动子

序列上存在一定差异，造成不同的程序预测效果也

不尽相同，因此应采用多个程序进行预测并结合实

际经验综合考虑，确定最有可能的基因结构。目前未

见有专门用于杨树基因组结构的分析软件，不过

Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ网站的ＦＧＥＮＥＳＨ，提供了多个物种（人类、

老鼠、果蝇、拟南芥、烟草、水稻、玉米等

）的预测功能，

其中双子叶拟南芥选项可用来预测杨树的基因组结

构，预测结果比较理想，而且预测的准确性高于其他

程序。

的时空特异性，可根据其功能预测或其他物种同源

基因或测定各个时期和不同组织的表达谱而加以判

断；

（３）以同源关系较远的蛋白或核酸作为查询探针，

可借助基因结构预测软件，使得结构分析变得简单

而且准确。目前，还没有专门用于预测杨树基因组结

构的软件，我们在利用基因组序列结构分析时，采用

Ｓｏｆｔｂｅｒｙ双子叶植物拟南芥的预测系统进行，预测的

结果还是比较准确、可信的。美国学者陈宗明实验室

（Ｔｕｓｋａｎｅｔａｌ．，２００６）利用生物信息学软件预测了毛果

杨所有的预期基因，并与拟南芥相比，发现了一些杨

树所特有的新基因，这是个令人兴奋的事情，但目前

暂停留在预测层次上，还有待于实验的进一步验证。

３

电子克隆的问题和展望

电子克隆最初是随着人类基因组和ＥＳＴ计划而

近年来，已成

与传统基因克隆法相比，电子克隆有很多优点，

产生和发展的（ＧｉｌｌａｎｄＳａｎｓｅａｕ，２０００），

但也存在一些问题，比如一些功能基因的保守性比

功地应用于一些植物物种的功能基因的克隆

（林慧贤

较低，ＥＳＴ数据的不完善，从基因组结构预测获得的

等，２００１；黄骥等，２００２ａ；２００２ｃ；唐向荣等，２００２）。

２００３年底毛果杨基因组序列测序完成及其资料免费

公开发布，以及日益丰富的杨树ＥＳＴ数据（Ｓｔｅｒｋｙｅｔ

ａｌ．，２００４），使电子克隆分离杨树基因成为可能，并能

极大加速杨树新基因的发现和功能鉴定研究。可以

预期，不久的将来，电子克隆必在杨树基因克隆及其

功能研究上发挥越来越重要的作用，甚至成为一种

必要手段。与传统的基因克隆方法相比，电子克隆主

要有以下优点：速度快、成本低、技术要求低、常规设

备即可、针对性强。采用

ＥＳＴ进行电子克隆的方法获

基因，有时难以获知其表达的时空效应等等。针对这

些问题，黄骥等（２００２ｂ）在进行水稻电子克隆策略时，

提出一些相关的解决方案：（１）根据５＇端的起始密码

子ＡＵＧ的周围序列（ＧＣＣ）ＧＣＣＡ／ＧＣＣＡＵＧＧ规则、

在起始密码子上游的同阅读框序列中是否存在终止

密码子和与其他物种同源基因的５＇端序列的一致性

比较以及

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果判断目的基因转录本的

（２）利用

大小，这几条原则来获得完整的

５＇端序列；

基因组结构预测获得的基因，往往难以确定其表达

略策的因基能功树杨离分隆克子电行进库据数ＥＳＴ和组因基用运

ＤａｔａｂａｓｅＥＳＴａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｅＧｅｎｏｍｅＰｏｐｕｌｕｓｏｎＢａｓｅｄＧｅｎｅｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰｏｐｕｌｕｓＣｌｏｎｉｎｇｓｉｌｉｃｏｉｎｆｏｒＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ

５８７

得全长ｃＤＮＡ的策略，可能会取代ＲＡＣＥ或ｃＤＮＡ

文库筛选的方案，并成为克隆基因的不可缺的强大

的辅助方法之一。此外，电子克隆技术的产生很可能

使学者们关注的焦点直接投入到克隆基因和功能研

究上，各实验室将可以轻易地获得具有自主产权的

目的基因，并构建基因克隆－转基因功能研究的实

验体系，这必将加速杨树生长发育的分子调控机制

研究，推动功能基因组学、比较基因组学、蛋白组学

和代谢组学的发展，同时，也将促进利用基因工程技

术进行杨树或者其它经济农林作物品种改良和新品

种的培育，以及加速其它木本植物的生理及遗传特

性的分子机制研究。

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