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2024年6月28日发(作者：replace有被动语态吗)
Vol.
11
,
No.
1
Jan.
,
2021
环境工程技术学报
Journal
of
Environmental
Engineering
Technology
第
11
卷
，
第
1
期
2021
年
1
月
杨凯
，
张硕
，
崔康平
，
等•活性污泥胞外聚合物中蛋白
质定量方法的评价&
J
•环境工程技术学报
,
2021
,
11
(
1
):
144-150.
YANG
K
,
ZHANG
S
,
CUI
K
P,
et
al.
Evaluation
of
protein
quantification
metUods
for
extracellular
polymers
in
activated
sludge
&
J
'.
Journal
of
Environmental
Engineering
Technology
,
2021
,
11
(
1
)
:
144-150.
活性污泥胞外聚合物中蛋白质定量方法的评价
杨凯
1
,
张硕
2
，
崔康平
1
,
黑生强
2
，
吕学敏
2
,
宋广清
2
,
张弦
2
，
黄霞
2
*
1.
合肥工业大学资源与环境工程学院
2
.
环境模拟与污染控制国家重点
联
合实验室
，
清华大学环境学院
摘要
胞外聚合物
(
EPS
)
中蛋白质的准确定量对研究活性污泥性质具有重要意义
。
为对
EPS
中蛋白质定量方法的选择提供
依据
，系统评价了
Modified
Lowry
法
、
BCA
法
、
Bradford
法的测试性能
，
包括测试范围
、
准确度
、
精密度及对
EPS
中部分组分
(
Cf
2+
、
Mg
u
、
还原性糖
、
腐殖酸)的抗干扰性
。
结果表明:
Modified
Lowry
法在蛋白质浓度为
1
~
10
.
10
-
100
mg/L
时与吸光度
的线性相关性较好
(
4
>0.
99
)
,
BCA
法和
Bradford
法的测试范围较
Modified
Lowry
法更宽
;
Modified
Lowry
法的准确度和精密
度均最高
,
BCA
法次之
‘
Bradford
法最低;
Modified
Lowry
法受
Ca
2+
、
Mg
2u
和还原性糖干扰
，
BCA
法受还原性糖和腐殖酸干扰
，
Bradford
法受腐殖酸的干扰。
因此
,
EPS
中蛋白质定量方法的选择应从样品性质(蛋白质浓度范围
、
干扰物质种类及浓度)和
测试方法性能(测试范围
、
准确度
、
精密度和抗干扰性
)
2
个方面综合考虑
-
关键词
胞外聚合物;蛋白质定量
;
Modified
Lowry
法;
BCA
法
；
Bradford
法
中图分类号
:
X703.
1
文章编号
：
1674N91X(2021
)01-0144-07
doi
：
10.
12153/j.
issn.
1674N91X.
20200046
Evaluation
of
protein
quantitcation
methods
for
extracellular
polymers
in
activated
sludge
YANG
Kai
1
,
ZHANG
Shuo
2
,
CUI
Kangping
1
,
HEI
Shengqiang
2
,
LtiXuemin
2
,
SONG
Guangqing
2
,
ZHANG
Xian
2
,
HUANG
Xi
2
*
1.
School
of
Resources
and
Environmental
Engineering,
Hefei
University
of
Technology
2.
State
Key
Labomtorg
of
Environmental
Simulation
and
Pollution
Control,
School
of
Environment,
Tsinghua
University
Abstrace
Tha
accurata
quantificetion
of
proteins
in
extracellulav
polymeVc
substancas
(
EPS)
is
of
great
signigcenco
fov
studying
tUa
pmpertias
of
activated
sludgy.
To
proviga
a
basis
fov
tha
selection
of
protein
quanioocaioon
meihodson
EPS,iheiesipeeoemanceo/Modooed
Loweymeihod,
BCAmeihod,
B
ead
oed
meihod
was
sysimOicOly
evaluated,
including
tUa
test
rangy,
accumcy,
precision
and
tha
anti-inteVerenco
of
soma
componenis(Ca
2
u
,Mg
2
u
,eeducongsugaeand
humocacod)on
uaisondocaied
ihaiiheModooed
Lowey
meihod
showed
agood
aoneaeco
e
eaaioon
beiween
peoieon
concenieaioon
and
absoebanceon
iheeangeo/peoieon
concentration
of
1
-10
and
10-100
mg/L
(
R
2
>0.99)
)
and
tha
test
rangy
of
BCA
metUod
and
Bradford
method
was
d
Loweymeihod had
ihehoghesiaccueacyand
peecosoon,BCA
meihod
eanked
ihesecond,and
Bead
oed
meihod
s,Modooed
Loweymeihod
wasaecied
byCa
2
u
,Mg
2
u
and
eeducongsugae;
BCAmeihod
wasaecied
byeeducongsugaeand
humocacod;and
Bead
oed
meihod
wasaecied
byhumocacod.
Therefora,
tha
choice
of
protein
quantigcation
method
in
EPS
should
ba
compmhensiely
considered
from
tUa
two
aspecisoosampaepeopeeioes(peoieon
con
ien
i
eange,
on
ie
eoe
eence
spec
oes
and
concenieaioon
)and
iesimeihod
peeooemance(iesieange,accueac:,peecosoon
and
anio-onieeoeeence).
收稿日期
：
2020-13-09
基金项目
：
科学技术部中日国际项目
(
2016YFE0118500
)
作者简介:杨凯
(
1993
—)
，
男
，
硕士
，
研究方向为膜污染机理
,
yangkai986155252@
163.
com
*
责任作者
:黄霞
(
1965
—
)
，
女
，
教授
，
博士
，
研究方向为膜法水与废水处理新技术的研究与应用
,
xhuang@
tsinghua.
edu.
cn
第
1
期
杨凯等:活性污泥胞外聚合物中蛋白质定量方法的评价
-
145
-
Key
words
extracellular
polymeric
substances;
protein
quantification;
ModVied
Lowry
method;
BCA
method;
Bodford
method
活性污泥法是污水处理中最常用的技术
，
主要
利用活性污泥的生物凝聚
、
吸附和氧化作用去除水
中污染物
。
胞外聚合物
(
extocellulos
polymeric
substances
,
EPS
)
是活性污泥的主要成分之一
,
对活
性污泥的结构
、
絮凝性
、
沉降性
、
表面电荷和脱水性
能等均具有重要影响
&
1-
'
。
EPS
的组成主要包括蛋
白
质
、
碳水化合物
、
腐殖质
、
DNA
及其他小分子物
质&其中
，
蛋白质被认为与
EPS
的结构和功能
均有重要联系
&
6
创
,
Wu
等⑼研究认为污泥絮凝体的
结构及稳定性与
EPS
中蛋
白
质浓度和种类有关
;
Felipe
等
&
10
'
研究认为活性污泥沉降性能的改变与
EPS
中蛋白质浓度变化有关
-
因此
,
EPS
中蛋白质
的准确定量对研究活性污泥性质具有重要意义
-
目
前
EPS
中蛋白质的量化存在较大差异
，
一方面与
EPS
的提取方法有关
&
11
'
，
另一方面与
EPS
中蛋白质
的不同定量方法有关
-
蛋白质的定量方法较多
，
包括凯氏定氮法
、
荧光
分析法
、
双缩月尿法
、
Lowry
法
、
Modified
Lowry
法
、
BCA
法
、
BT
(
foO
法等
&
12T8
'
，
其中
‘
Modified
Lowry
法
、
BCA
法
、
BadfoO
法具有测试操作简便
，测试准确性较高
等优势
，
已被广泛用于废水中蛋白质的定量
&
19-1
'
-
但这
3
种方法的测试范围
、
准确度
、
精密度均存在差
异
。
此外
，
这
3
种方法可能受到
EPS
中部分组分的
干扰
，
如
Shen
等
&
22
'
报道了
Co
2+
和
Mg
2u
对
Modified
Lowry
法的准确性存在影响
；
Feiz
等
&
23
'
报道了活性
污泥中存在还原性糖将影响
BCA
法的测试结果;
Le
等&
24
'认为腐殖酸会对
BCA
法和
Bodford
法的测试
产生干扰
。
但目前对上述
3
种方法的测试范'
、
准
度
、
精密度和
性污
EPS
中
组
干扰能力的系统评价鲜见报道
。
笔者评价了
Modified
Low
—
法
、
BCA
法和
Bodford
法的测试范
'
、
准确度
、
精密度及对活性污泥中
Co
2u
、
Mg
2u
、
还
性
和
性
，
期
EPS
中
白
质
定量方法的选择提供依据
-
1
材料与方法
1.
1
Modified
Lowry
法
Modified
Lowry
法是由
Fylund
等
&
15
'
在
Low
—
法
基础上针对腐殖酸干扰提出的改进方法
。
Low
—
法
的原理是在碱性介质中蛋白质将
Cu
2+
还原成
Cu
+
，
产生
Cu
+
-
蛋
白
复合物
。
该复合物与
Folin
试剂发生
显色反应
，
其颜色深浅与蛋白质浓度成正比
，
采用比
色法在
750
nm
波长下测定吸光度(
I
)
&
24
'
-
为减少
Modified
Low
—
法测试时间
，
对
Shen
等
&
22
'
提出的测试流程和试剂用量进行了改进
，提出
如图
1
所示的测试步骤
，
蛋
白
质吸光度的计算公式
见式
(
1
)
〜式
(
3
)
，
试剂的配制见表
1
-
Modified
Lowry
法
[0.35 mL
试剂
1
0.25
mL
样品
]
(
0.25
mL
样品
0.35
mL
试剂
2
]
(
~~
J
][
~~
J
]
J
J
[
静置
10
min
]
(
静置
10
min
[
力蛋白质
图
1
Modified
Lowry
法的测
试
步骤
Fig.
1
Test
procedure
for
Modified
Lowy
method
1
加
CuSO
4
蛋白质
+
1
腐殖酸
(
1
)
1
1
不加
CuSO
4
2
x
I
蛋白质+加腐殖酸
(
2
)
白质
-
1
-
25
X
(
蛋加
CuSO
4
-
蛋不加
CuSO
4
)
(
3
)
表
1
Modified
Lowry
法
试
剂
的
配
制
Table
1
Preparation
of
test
reagents
for
Modified
Lowy
method
试剂名称
配制过程
A
0.
57
g
NaOH
和
2.86
g
Na
2
CO
3
加超纯水定容至
100
mL
B
1.
43
a
CuSO
4
-
5H
2
O
加超纯水定容至
100
mL
C
2
-
85
g
NgC
4
O
6
-
2H
2
O
加超纯水定容至
100
mL
试
1
将试剂
A
、
B
、
c
以体积比
100
：
1
：
1
混合
(
试剂
B和试剂
C
先混合
)
试
2
将试剂
A
、
纯水、
试剂
C
以体积比
100
：
1
：
1
混合
试
3
将
Folin-
酚(
2N
)
试剂和纯水以体积比
1
：
1
混合
1.2
BCA
测试原理:在碱性条件下蛋白质将
Cu
2+
还原成
Cu
+
，
Cu
+
与
BCA
分子结合生成紫色络合物
，
其颜色深
浅与蛋白质浓度成正比,采用比色法在
562
nm
波长下
测定
度
-
测试步骤:取
20
"
L
样品置于酶标板中
，
加入
200
-
146
-
环境工程技术学报
第
11
卷
"
L
BCA
工作液(某品牌试剂盒)
，
室温
(
25
±2
)
｝
下静
置
120
min
,
于
562
nm
波长下测定吸光度
。
1.
3
Bradforr
法
测试原理:考马斯亮蓝
GN50
染料在酸性条件与
精氨酸
、
组氨酸
、
苯丙氨酸
、
色氨酸和酪氨酸残基相互
作用显色&刃
，
颜色深浅与蛋白质浓度成正比
，
采用比色
法在
595
nm
波长下测定吸光度
-
Mg
2u
(
0
、
1
、
2
、
5
mmol/L
)
,
葡萄糖(
0
、
1
、
2
、
5
mmol/L
)
,
腐
殖酸(
0
、
10
、
20
、
50
、
100
mg/L
)
与
BSA
的混合溶液
，
用
3
种定量方法测定混合溶液的吸光度,每个样品设置
3
次平行
(
％
=3
)
。
1.5
仪器与试剂
吸光度测定使用
MD
SpectmMax
型多功能酶标仪
测试步骤:移取
5
"
L
样品至酶标板中
，
加入
250
"
L
考马斯亮蓝
G-250
染色液(某品牌试剂盒
)
，
在室温
下静置
10
min
,
于
595
nm
波长下测定吸光度-
1.
4
蛋白质定量方法测试性能评价
1.4.1
浓度测试范围评价
配制
0-1
.
1-10
.
10-100
.
100
-
2
000
mg/L
4
组浓
(美国
Molecuav
Devicas
公司)可见光分光光度模块-
氯化钙
(
CaCt
•
2
比
0
)
、
氯化镁
(
MgCl
-
6
比
0
)
、
葡萄糖
(
C
6
H
2
O
6
•
比
0
)
、
硫酸铜
(
C
u
SO
：
/
5
比
0
)
、
酒石
酸钠
(
Na
2
C
：
O
6
•
2H
2
O
)
均为分析纯
，
购自国药集团化
学试剂有限公司
；
BSA
、
Folin-
酚
试剂
(
2N
)
购自
Sigma-
AldVch
(上海)贸易有限公司;腐殖酸购自
MACKLN
度梯度牛血清蛋白#
bovina
serum
albumin
,
BSA
)
标准
溶液
，
考察
3
种方法在不同
BSA
浓度范围内与吸光度
的线性相关性
,
环样品设置
3
次平行(
”
=3
)-
1.4.2
准确度和精密度评价
在浓度测试范围评价的基础上
，
选定
3
种方法相
BSA
度范围,
步
3
测试
性范围内准确度和精密度,每个样品设置
8
次平行
(%
=8
)
。
准确度由相对误差
(
relative
exor
,
RE
)
衡量
。
采用
T
检验对测试值和真实值进行差异性检验
，
检验
假设为测试值和真实值有显著性差异
，
检验参数
P
越
大表明测试值与准确值差异性越小
。
精密度由相对标
准偏差
(
relative
standard
deviation
,
RSD
)^!^-
1.4.3
抗干扰性评价
分别配制不同浓度的
Co
2u
(
0
、
1
、
2
、
5
mmol/L
),
(上海
)
生化科技有限公司
；
BCA
试剂盒和
Bradford
试
剂盒均购自某生物技术公司;试验用水均为超纯水
。
2
结果与讨论
2.1
测试范围评价
BSA
度
别
0
-1
、
1
-10
、
10
-100
、
100
-1
000
mg/L4
组
度
白
质
度与
度
性
性
果如表
2
所示
。
由表
2
可见,
Modified
Lowry
法在
BSA
浓度为
1
~
10
和
10-100
mg/L
时有较好的线性相关性
(
R
2
>0.99
),
BCA
法在
BSA
浓度为
10-100
和
100
-
2
000
mg/L
范围内线性相关性较好
(
4
>0.99
),
Bradford
法在
BSA
浓度为
20-100
和
100
~
1
500
mg/L
范围内线性相关性较好
(
4
>0.
99
)
-
表
2
3
种方法不同
BSA
浓度范围的线性相关性比较(
”
=3
)
Table
2
Comparison
of
linecv
correlafon
of
iree
metUods
wii
dOemnt
BSA
conceneation
ranges
(%
=3)
方法
BSA
浓度
/(
mg/
)
0-1
BSA
浓度线性范围
/(
mg/L
)
拟合方程
c
=
-0.
004
5
l
+0.016
线性相关系数
(
4
)
0.357
2
0.992
8
Modoooed
Lowey
1-10
0-10
C
=0.005
1
x+
0.
010
10
-10010
-100
y
-U.
UU3
9
x
+
U.
0230.996
0
0.202
4100
-2
000
0-1
BCA
C=0.
000
2%+0.
051
y
-0.
001 3
l
+
0
0980.300
3
0.490
9
0.991
3
0.993
7
0-10
10
-100
000
7
%
+0.134
10
-100
100
-2
000
y=0.
001 6
l
+0.126
y
-0.
001
0
x
+
0
266
100
-2
000
0-1
y-0.
008
1
1
+0.445
y
=
-0.
000
5
l
+0.477
0.310
8
0.094
4
0.990
3
0.992
1
0-10
Bradford
法
10
-100
20
-100
100
-1
500
y
-0.
000
8
l
+
0
466
y
-0.
000
4
x
+
0
538
100
-2
000
2.2
准确度和精密度评价
在确定测试范围的基础上
，
在
3
种方法共同测试
范围
(
20
-
100
mg/L
)
内选定
BSA
浓度为
50
和
100
mg/L
,
对比定量方法的准确度和精密度
，
结果见图
2
-
第
1
期
杨凯等:活性污泥胞外聚合物中蛋白质定量方法的评价
-
147
-
准确度和精密度对比见表
3
。
由表
3
可知
,
3
种定量方
法
、
BCA
法和
BodfoO
法
。
差
异性检验
(
P
)
表明
,
3
种
法的准确度由高到低依次为
Modified
Low
—
法
.
BCA
法
和
BodfoO
法
;
精密度由高到低依次为
Modified
Low
—
56
方法的测试值与真实值的差异程度由低到高依次为
Modified
Low
—
法
、
BCA
法和
Bodford
法
。
54
52
50
48
46
44
42
40
38
Modified
Lowry
法
BCA
法
Bradfrd
法
Modified
Lowry
法
BCA
法
Bradfrd
法
(a)
真实值为
50
mg/L
(b)
真实值为
100
mg/L
图
2
3
种方法定量
50
(
100
mg/L
BSA
的测试数据分布
(%
=8
)
Fig.
2
Distobution
of
test
date
by
three
methods
to
quantify
50
and
100
mg/L
BSA
(
n
二
8
)
表
3
3
种方法的准确度和精密度比较
(
%=8
)
Table
3
万医
Modified
L
ow
—
法
Compadson
of
test
accuracy
and
pocision
of
thoe
methods
(
n
q8
)
BSA
浓度为
50
mg/L
BSA
度
100
mg/L
RE/%
P
RSD/%
2.40
3.66
9.28
RE/%
P
RSD/%
0.72
2.92
0.433
0.064
0.06
2.67
0.989
0.007
0.008
1.70
2.07
4.10
BCA
Bradford
法
7.72
0.005
4.97
2.3
抗干扰性的评价
2.3.1
Co
2+
和
Mg
2
+浓度的影响
采用
Modified
Low
—
法
、
BCA
法和
BodfoO
法测定
含不同浓度
Co
2+
和
Mg
2+
的
BSA
溶液的吸光度
，
建立
0
□
1
o
2
A
40
°-
0
o
-
5
o
0
°-
0
3
0
5
0
-
0
-
5
d
0
d
5
-
0
-
5
d
0
o
20
40
60
BSA
度与
度
拟合
,
比
拟合
和
标准曲线(不加干扰物质时的拟合曲线)判断
Co
2+
和
Mg
2
^tW
测试方法的干扰程度
，
结果如图
3
和图
4
所
示
。
o
l
>
06
m
m
m
m
2
r
人
2=0.995
0
7?
2
=0.995
0
7?
2
=0.995
0
，
=0.994
0
80
100
(b)
BCA
法
BSA
浓度
/(mg/L)
(a)
Modified
Lowry
法
(c)
Bradford^
图
3
含不同浓度
Ca
2
+
时
BSA
浓度与吸光度的拟合曲线(
％
=3
)
Fig.
3
Fitting
cuoes
of
BSA
concentration
and
absorbance
wth
diVeont
concentrations
of
Co
2
+ (
n
二
3)
由图
3
(
o
)
可见,
Modified
Low
—
法在
Co
2+
浓度分
别为
1
.
2
.
5
mmol/L
时
，
拟合曲线较标准曲线向下偏移
较大,即吸光度测试值偏低
，
导致蛋白质定量结果偏
低,且干扰程度随
Co
2
+
浓度增加而增大
。
此外,
@
2
+
浓
-
148
-
环境工程技术学报
oo
o
o
o
o
O
O
3
X+
0.
3
X+
0.
3
X+
0.
3
X+
0.
o
13
14
o
14
o
15
O
第
11
卷
1/L
1/L
1/L
)1/L
-
o0
o2
5
_
o20
-
OJ
5
CQ
o
1
mmol/L
尸
△
2
mmol/L
尸
▽
5
mmol/L
尸
0.40
-
0.62
口
0
mmol/L
尸
°
35
-
0.60
0.58
0.30
-
璽
0.25
-
密
0・20
0.15
-/
誓
°
56
普
0.54
菸
山
0.52
0
讣
1O
-
O
5
—
—
—
----------------------------------------
'
0.10
：
L
------------------------------------------------
0
20
40
60
80
100
0 50
100
150
200
BSA
浓度
/(mg/L)
BSA
浓度
/(mg/L)
(a)
Modified
Lowry
法
(b)
BCA
法
0.481
0
50
100
150
BSA
浓度
/(mg/L)
200
(c)
Bradford^
图
4
含不同浓度
Mg
2
+
时
BSA
浓度与吸光度的拟合曲线(
％
=3
)
Fig.
4
Fitting
cuoee
of
BSA
concentration
and
absorbance
with
dideont
concentrations
of
Mg
2
+
(
n
=3)
度相同时,蛋白质浓度越低测试所受干扰越大
，
如
Cv
2
+
度和
度
拟合
,
果见
5
-
向
大,
5
见,
浓度为
2
mmol/L
时
，
对浓度为
25
.
50
.
100
mg/L
的
BSA
测试造成的
RE
分别为
62.
84%
.
29.
73%
.
15.
96%
-
葡萄糖浓度分别为
1
、
2
、
5
mmol/L
时
‘
Modified
Lowry
法
拟合
度
高,
由图
4
(
a
)
可见
‘
Modified
Lowp
法在
Mg
2+
浓度为
1
.
2
.
5
mmol/L
时
，
拟合曲线较标准曲线向下偏移较小
。
导致蛋白质浓度测试值偏高
，
且测试干扰程度随葡萄
糖浓度增加而增大
。
葡萄糖浓度相同时
，
蛋白质浓度
越低
，
测试所受干扰越大
，
如葡萄糖浓度为
2
mmol/L
表明
Mg
2
+
对
Modified
Lowp
法的干扰比
@
2
+
更低
。
由图
3
(
b
).
图
3
(
c)
和图
4
(
b
)
、
图
4
(
c)
可见
,
BCA
法和
Bodford
法在
Cv
2+
和
Mg
2+
浓度为
1
、
2
、
5
mmol/L
时
，
拟合曲线较标准曲线均无明显偏移
。
表明
Cv
2+
.
Mg2
+
对
BCA
法和
Bodford
法的测试结果均无明显
时
，
对
BSA
浓度为
25
.
50
.
100
mg/L
的测试造成的
RE
分别为
34.
7%
.
18.
6%
.
9.
8%
-
BCA
法测试受葡萄糖
的干扰与
Modified
Lowry
法类彳
，
但相同浓度葡萄糖对
BCA
法的测试干扰更显著
，
如葡萄糖浓度为
2
mmol/L
干扰-
Shen
等&
22
'研究表明
,
Cv
2+
.
Mg
2+
在富含
CO
訂和
OH
的
Lowp
试剂中易形成
CaCO
s
和
Mg
(
OH
)
2
沉淀
,
时
，
对
BSA
浓度为
25
.
50
.
100
mg/L
的测试造成的
RE
分别为
79.
4%
.
47.
6%
.
20.
5%
。
葡萄糖浓度分别为
1
.
2
.
5
mmol/L
时
,
BoU
(
wd
法的拟合曲线较标准曲线均无
沉淀物在测试波长下发生光散射
，
使
I
不加
cuso
4
增加,
明显差异,表明葡萄糖对
Bodford
法的测试结果无显
-
葡萄糖对
Modified
Lowp
法和
BCA
法的测试产生
干扰的主要原因是
：
2
种测试方法中
Cu
+
均起重要作
用
，
碱性条件下葡萄糖中的醛基将
Cu
2
+
还原
，
产生更多
I
蛋白质降低
，
导致蛋白质定量结果偏低
。
Cv
2+
对
Modified
Lowry
法测试干扰比
Mg
2+
更明显,是由于
CaOO
的光散射强度大于
Mg
(
OH
)
2
&
26
曝
7
'
，
使得不蛋白质更
小
，
导致蛋白质定量结果更低
-
BCA
法对
Cv
2+
、
Mg
2+
具有较好的抗干扰能力
，
原
的
Cu
+
&
28
'
，
使显色加深
，
吸光度增加
，
导致蛋白定量结
果偏高
。
而
Bodford
法试剂中不含
Cu
2+
,
因此还原性
因可能是测试试剂中酒石酸钠浓度较高,其可与
Cv
2+
.
Mg2
+
形成络合物
，
从而降低对蛋白质定量的干扰
;
BCA
糖的存在对
Bodford
法的测试无明显干扰
-
2.3.3
腐殖酸浓度的影响
法样品与测试试剂的体积比更低#
Modified
Lowp
法为
5
：
8
,
BCA
法为
1
：
10
)
，
工作液对样品中的
Cv
2+
、
Mg
2+
稀
由于
Fplund
等&
15
'提出的
Modified
Lowp
法已对
腐殖酸的干扰做出了修正
，
该方法可实现对蛋白质和
腐殖酸的同步定量
。
因此
，
本研究仅考察腐殖酸浓度
BCA
和
Beadooed
测试
影响,
果见
6
-
释程度更高
。
Bodford
法对
Cv
2+
.
Mg
2+
具有较好的抗
干扰能力
，
原因可能是测试试剂显弱酸性
,
Cv
2+
、
Mg
2
+
不会形成沉淀干扰测试
-
2.3.2
葡萄糖浓度的影响
图
6
可见
，
腐殖酸浓度分别为
10
.
20
.
50
.
100
mg/L
时,
BCA
法和
Bodford
法的拟合曲线较标准曲线向上偏移
采用
Modified
Lowry
法
、
BCA
法和
BodCwd
法测定
含不同浓度葡萄糖的
BSA
溶液的吸光度并建立
BSA
大,
度
高-
表
BCA
测试
第
1
期
杨凯等:活性污泥胞外聚合物中蛋白质定量方法的评价
□
0
mmol/L
尸
0.001
lx+0.132
0
疋
=0.995
0
O
1
mmol/L
尸
0.001
lx+0.151
0
7?
2
=0.994
0
a
2
mmol/L
j=0.001
lx+0.177
0
7?
2
=0.996
0
▽
5
mmol/L
尸
0.001
lx+0.237
0
7?
2
=0.994
0
0.50
r
-
149
-
0
20
40
60
80
BSA
浓度
/(mg/L)
100
BSA
浓度
/(mg/L)
(b)
BCA
法
BSA
浓度
/(mg/L)
(c)
Bradford^
(a)
Modified
Lowry
法
图
5
含不同浓度葡萄糖时
BSA
浓度与吸光度的拟合曲线(
％
=3
)
Fig.
5
Fitting
cumes
of
BSA
concentration
and
absorbance
with
digemnt
concentrations
of
glucose
(
%
=3)
□
0
mg/L
o
10
mg/L
△
20
mg/L
0.55
-
v50
mg/L
◊
100
mg/L
0.50
0.45
尸
0.001
5x+0.015
0
尸
0.001
5x+0.110
0
尸
0.001
5x+0.114
0
尸
0.001
5x+0.141
0
尸
0.001
5x+0.204
0
圧
=0.999
0
人
2=0.999 0
人
2=0.998
0
人
2=0.999 0
人
2=0.999 0
□
0
mg/L
o
10
mg/L
△
20
mg/L
0.64
-
v
50
mg/L
0.62
-◊100
mg/L
尸
0.000
8x+0.447
0
尸
0.000
8x+0.448
0
尸
0.000
8x+0.450
0
尸
0.000
7x+0.464
0
尸
0.000
6x+0.477
0
Z.994
0
7?
2
=0.998
0
7?
2
=0.997
0
雇
0.994
0
7?
2
=0.995
0
0.60
0.58
0.40
0.35
0.56
泪
0.54
0.52
0.30
0.25
0.50
0.48
0.20
0.15
0.46
0.44
50
°-
1
%
100
150
ESA
浓度
/(mg/L)
(a)
BCA
法
200
0.42
50
100
150
ESA
浓度
/(mg/L)
(b)
Eraofbrd
法
200
图
6
含不同浓度腐殖酸时
BSA
浓度与吸光度的拟合曲线
(
%
=3
)
Fig.
6
Fitting
cumes
of
BSA
concentration
and
absorbance
with
diffemnt
concentrations
of
humic
acid#
%
=3)
结果产生干扰
，
使测试结果偏高
，
且随腐殖酸浓度的升
高,干扰程度增强
。
腐殖酸浓度相同时
，
蛋白质浓度越
浓度范围内线性相关性好
(
R
2
>0.
99
),
该方法适合
低浓度蛋
白
质的定量
；
BCA
法在
10
-
100
.
100
-
2
000
mg
紫浓度范围内具有较好的线性相关性
(
R
2
>0.
99
)
；
Bradford
在
20
-
100
.
100
-
1
500
mg/L
低测试所受干扰越大
。
如腐殖酸浓度为
50
mg/L
时,
BCA
法对浓度为
25
.
50
.
100
mg
紫的
BSA
测试造成的
RE
分别为
93.
3%
.
51.
4%
.
24.
8%
,
Bradford
法分别为
浓度范围内具有良好的线性相关性
(
R
2
〉
0.99
)-
(
2
)
在共有测试
范围
(
20
-
100
mg/
)
内,
Modified
Lowry
法的准确度和精密度均最高,
BCA
法
72.
8%
.
35.
1%
.
4.
0%
o
腐殖酸浓度由低到高显色为棕色至黑色
，
在
BCA
法和
Bradford
法所对应的测试波长下均有一定吸
光度&
29
'
，
会造成样品吸光度升高
,
从而导致蛋白
质定
量
果
高
o
次之
,
Bradford
法最低
-
(
3
)
Ca
2+
、
Mg
2+
和葡萄糖干扰
Modified
Lowry
法
测试,葡萄糖和腐殖酸干扰
BCA
法测试
，
腐殖酸干
3
结论
(
1
)
3
种方法中蛋白质浓度与吸光度的线性相
扰
Bradford
法测试
°
(
4
)
EPS
中蛋白质定量方法的选择应综合考虑
测试对象的蛋白质浓度
、
干扰物质种类和测试方法
关性表现:
Modified
Lowry
法在
1
〜
10
.
10
-
100
mg/L
的测试范'
、
准确度
、
精密度和抗干扰性
。
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