脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤及MMP_2_MMP_9表达的影响

・

328

・

CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINEONCARDIO-/CEREBROVASCULARDISEASE

April

2007

Vo1.5

No.4

随着益气药物剂量的增加

,

其治疗作用相应增强。

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.Mactrophagfoamcells

fromexperimentalatheromaconstitutivelyproducematri-degrading

proteinase[J].ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:402-406.

)

,

男

,

现为山西医科大学第二临床医学院硕士作者简介

:

张永波

(

1981

—

研究生

(

邮编

:030001

)

;

李丽

,

工作于山西医科大学第二医院。

(

收稿日期

:2006-12-29

)

(

本文编辑郭怀印

)

脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤及

1

)

MMP-2

、

MMP-9

表达的影响

余　锋

,

胡向阳

,

董六一

,

王文静

,

李淮玉

,

任明山

摘要

:

目的　观察脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织病理变化及

MMP-2

、

MMP-9

表达的影响

,

并探讨其可能的

保护机制。方法　建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型

,

应用

HE

及

S-P

免疫组化法分别观察模型组及用药组大鼠全脑组织的病

理改变及

MMP-2

、

MMP-9

表达的变化。结果　假手术组大鼠脑组织形态结构正常

,MMP-2

、

MMP-9

见少量散在阳性表达或

不表达

;

模型组大鼠大脑缺血再灌注区组织明显水肿、蜕变、坏死伴少量炎细胞浸润

,

对侧大脑相应区及双侧小脑轻度水肿

,MMP-2

、

MMP-9

表达较假手术组对应区显著升高

(

P

<0.01

或

P

<0.05

)

,

其中缺血侧大脑以坏死区边缘脑组织表达为甚

,

且较对侧大脑及

双侧小脑明显升高

(

P

<0.05

)

;

脑心通用药组大鼠大脑缺血区组织水肿、蜕变、坏死较模型组明显减轻

,

对侧大脑相应区及双侧小脑

脑组织形态结构正常

,MMP-2

、

MMP-9

表达较模型组对应区显著降低

(

P

<0.05

)

。结论　脑心通胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌

注后包括病灶在内的全脑损伤有保护作用

,

其作用机制可能与降低

MMP-2

、

MMP-9

表达有关。

关键词

:

脑缺血

;

再灌注

;

脑心通胶囊

;

免疫组织化学

;

大鼠

中图分类号

:R743.31

R285.6

　　　文献标识码

:A

　　　文章编号

:1672-1349

(

2007

)

04-0328-03

EffectsofNaoxingtongonExpressionandSignificanceofMMP-9andMMP-2inCerebralTissuesof

RatafterFocalCerebralIschemiaandReperfusion

YuFeng,HuXiangyang,DongLiuyi,

etal

DepartmentofNeurology,AnhuiProvincialHospital

(

Hefei230001

)

Abstract:Objective

ToobservetheinfluenceofNaoxingtongonhistologicalchangesaswellastheexpressionofMMP-2andMMP-9

incerebraltissuesofratafterfocalcerebralischemiaandreperfusion,s

Forty-fiveratswererandomizedinto3groups

(

n

=45

)

:Shamoperationgroup

(

n

=5

)

,ischemiawithreperfusiongroup

(

n

=20

)

,

Naoxintongpre-treatedgroup

(

n

=20

)

.Rightintraluminalmiddlecerebralarteryocclusionwithreperfusionwasinducedin40rats,and

sion

s

Histologicalchangesofinjuryandinflammationwere

reeinNaoxintongpre-treatepression

ofMMP-9andMMP-2wereseensparselyinthecontrolspecimens,andweremarkedlyincreasedaftertransientfocalcerebralischemia

andreperfusion

(

P

<0.05

)

.ExpressionofMMP-2andMMP-9aswellasvasogenicedemacouldbeobservednotonlyinthelesionitself

(

P

<0.01

)

butalsoinperilesional

(

penumbra

)

,widespreadipsi-andcontralateralremoteareas

(

P

<0.05

)

.Obviousdecreasedexpres

2

sionofMMP-9andMMP-2wereobservedinNaoxintongpre-treatedgroupcomparedwiththatinischemicwithreperfusiongroup

(

P

<

0.05

)

.Conclusion

Naoxingtongcontributedtorelievetheallpartsofcerebralinjurycausedbytransientfocalcerebralischemia/reperfu

2

sionanditsmechanismmightbeinvolveddown-regulationoftheexpressionofMMP-2andMMP-9.

Keywords:focalcerebralischemia;reperfusion;Naoxingtong;middlecerebralarteryocclusion;rat

1

)

为安徽省教育厅自然科学基金项目

(

No.2006KJ376B

)

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

中西医结合心脑血管病杂志

2007

年

4

月第

5

卷第

4

期

　　脑缺血再灌注后可出现脑水肿

,

加重因缺血、缺氧引起的神

经细胞损伤

,

并导致颅内压增高、脑疝等并发症

,

是中风病人早

期死亡的重要原因。再灌注损伤涉及到多方面的机制

,

近几年

研究发现

[1]

,

基质金属蛋白酶

(

matrixmetalloproteinases,MMP

)

尤其是其中的明胶酶

(

MMP-2

、

MMP-9

)

表达的异常是脑缺

血再灌注损伤的重要机制。临床实践表明脑心通在脑缺血再灌

注损伤治疗中有较好的疗效

,

但其确切机制尚不明

[2]

。鉴于

此

,

本研究旨在建立大鼠脑缺血

2h

再灌注

24h

模型

(

middle

cerebralarteryocclusion,MCAO

)

后

,

通过观察缺血再灌注组及脑

心通用药组大鼠脑组织的病理组织学改变及

MMP-2

、

MMP-

9

表达的变化以探讨脑心通在脑缺血再灌注损伤中的可能作用

及机制。

1

　材料与方法

1.1

　动物与分组　取健康成年

SpragueDawley

雄性大鼠

45

只

,

体重

250g

～

300g,

购自安徽医科大学实验动物中心

(

皖医

室动第

01

号

)

。饲养环境

:

温度

(

23

～

25

)

℃

,

湿度

60%

～

70%,

自然光照

,

复合颗粒饲料

,

自由饮水。将大鼠随机分成

3

组

:

假

手术组

(

5

只

)

、模型组

(

20

只

)

、脑心通组

(

20

只

)

。

1.2

　试剂　兔抗鼠

MMP-2

单抗、兔抗鼠

MMP-9

单抗、

S-

PKit

及

DAB

显色试剂均购自北京中山生物技术有限公司

(

除

S-PKit

为美国

Zymed

公司产品外

,

其余均系美国

Santa

—

Cruz

公司产品

)

。

1.3

　动物模型制作　参照

Zealonga

等

[3]

法

,

以

10%

的水合氯

醛

(

3.5mL/kg

)

腹腔注射麻醉大鼠

,

颈部正中切口

,

逐层分离暴

露右侧颈总动脉

,

靠近心端结扎

,

远心端做切口置入

2-0

鱼线

(

头端加热呈直径约

0.3mm

的圆球形

)

,

插入约

18mm

～

20mm

(

距

颈总动脉分叉处

)

,

鱼线。逐层缝合切口

,

鱼线残端留置切口外

约

5mm

。再灌注时

,

将鱼线拔出约

10mm

。模型成功的标志是

术后动物出现同侧

Horners

征及动物麻醉清醒后出现以左前肢

为主的偏瘫。给药途径

:

脑心通治疗组给予脑心通药液灌胃

(

2

g/kg;

给药容积

0.5mL/100g,

每天

1

次

,

连续

5d

)

,

于第

5

天灌

胃

1h

后手术制备局灶脑缺血再灌注模型

(

同上述模型组

)

,

假

手术组与模型组给予等量的生理盐水。再灌注

24h

后

,

断头取

脑

,

大脑、小脑均行冠状切面取材

,

其中大脑在以视交叉为中心

处冠状切面取材。假手术组大鼠不作缺血处理

,

也不予药物治

疗

,

取材部位同上。

右大脑

6.32

±

2.11

MMP-2

表达　

左大脑

7.02

±

1.87

右小脑

6.43

±

1.94

左小脑

6.69

±

2.24

・

329

・

1.4

　病理形态学　上述取材脑标本

10%

中性甲醛固定

,

石蜡

包埋

,5

μ

m

连续切片数张

,

其中

1

张行

HE

染色

,

其余作免疫组

化检测之用。

1.5

S-P

免疫组织化学法　组织切片先行煮沸抗原修复

,

具

体操作按说明书进行

,

一抗稀释度为

MMP-2

(

1

∶

150

)

、

MMP-9

(

1

∶

120

)

,

最后苏木精复染。阳性对照为已知的

MMP-2

、

MMP-9

阳性切片

;

阴性对照为用

PBS

代替一抗。阳性信号为

棕黄色。阳性计数

:

结合

HE

图像相应区

,

各组每只大鼠相应

部位均选

1

张切片

,

高倍镜下取

10

个视野

,

数阳性细胞数及阳

性血管数

,

然后取各组平均值。

1.6

　统计学处理　实验数据采用均数±标准差

(

x

±

s

)

表示

,

2

各组间比较采用

χ

检验及

t

检验

,

P

<0.05

为有统计学意义。

2

　结　果

2.1

　病理组织学改变　

5

只假手术组大鼠无

1

例死亡

,40

只造

模大鼠中除模型组死亡

3

例

,

用药组死亡

2

例外

,

其余均成功。

HE

染色后

,

假手术组大鼠大、小脑组织形态、结构正常。模型

组大鼠右侧大脑缺血区神经元及胶质细胞明显减少

,

残存神经

元固缩蜕变

,

间质高度水肿

,

少量炎细胞浸润

,

缺血边缘区脑组

织明显水肿

,

见少量格子细胞。左侧大脑对应区及双侧小脑呈

较轻的水肿改变。脑心通用药组大鼠右侧大脑缺血区神经元及

胶质细胞蜕变、间质水肿及炎细胞浸润较模型组明显减轻

,

左侧

大脑对应区及双侧小脑未见明显异常。

2.2

　免疫组织化学结果

(

见表

1

)

　在假手术组大鼠的双侧大

小脑组织

MMP-2

、

MMP-9

见少量散在阳性表达或不表达

,

其中

MMP-2

阳性表达略高

,

阳性定位主要在血管内皮细胞及

星形胶质细胞胞质、胞膜中。模型组大鼠双侧大小脑组织

MMP-2

、

MMP-9

表达较假手术组对应区域显著升高。其中

缺血侧大脑又较对侧大脑及双侧小脑明显升高

(

P

<0.05

)

。阳

性表达除定位于血管内皮细胞、星形胶质细胞胞质、胞膜外

,

也

见于神经元、小胶质细胞及炎细胞。从组织水平分布上

,

缺血侧

大脑组织以坏死蜕变区的边缘脑组织阳性表达为甚

,

对侧大脑

则呈较均匀的散在阳性表达

,

双侧小脑中均以Ⅳ脑室附近白质

的微小血管表达较明显

,

其次是小脑皮质神经元。脑心通组大

鼠双侧大小脑组织

MMP-2

、

MMP-9

表达较模型组对应区域

显著降低。

表

1

3

组不同部位脑组织中

MMP-2

、

MMP-9

的阳性表达

(

x

±

s

)

组别

n

右大脑

2.34

±

1.05

MMP-9

表达　

左大脑

1.99

±

1.08

右小脑

1.87

±

0.97

18.62

±

1.96

1

)

3.97

±

1.02

4

)

左小脑

2.12

±

1.06

20.55

±

2.25

1

)

4.33

±

1.32

4

)

假手术组

5

模型组

17

46.06

±

4.13

2

)

3

)

31.42

±

3.94

1

)

24.88

±

3.95

1

)

26.87

±

3.04

1

)

36.01

±

2.76

2

)

3

)

21.72

±

3.01

1

)

脑心通组

18

23.31

±

2.91

4

)

8.32

±

1.93

4

)

8.45

±

2.01

4

)

9.04

±

2.52

4

)

16.39

±

2.11

4

)

4.02

±

1.21

4

)

与假手术组比较

,1

)

P

<0

.

05

,

2

)

P

<0

.

01

;

与对侧大脑及双侧小脑比较

,

3

)

P

<0

.

05

;

与模型组比较

,

4

)

P

<0.05

3

　讨　论

现代神经科学认为

[4]

,

神经细胞、胶质细胞、微血管内皮细

基质金属蛋白酶是一组含锌酶的基因家族

,

其家族中的明胶酶

即

MMP-2

(

明胶酶

A

)

和

MMP-9

(

明胶酶

B

)

有一个纤黏蛋白

结合域

,

可降解

ECM

、破坏脑血管外基底膜主要成分

(

黏蛋白和

纤黏蛋白

)

从而破坏血脑屏障、改变毛细血管通透性导致血管源

性脑水肿甚至出血性转化。

本实验中

,

首先病理形态学检测结果显示假手术组脑组织

结构正常

;

缺血再灌模型组大鼠缺血区脑组织明显水肿、退变坏

死

,

说明造模成功。其次

,MMP-2

、

MMP-9

在假手术组不表

胞间的相互依存关系是组成和维持脑功能及结构的必要条件

,

血脑屏障参与血脑物质交换的调节

,

而神经元的直接生存微环

境是神经元和胶质细胞间的细胞间液即细胞外基质

(

ECM

)

。

脑组织中

ECM

是维持血脑屏障

(

BBB

)

结构完整性的重要组成

部分

,

其中基底膜尤为重要

,

它由

ECM

分子如Ⅳ型胶原、层黏

蛋白和纤维连接蛋白构成

,

为血管的完整性提供结构支持

[5]

。

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

・

330

・

CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINEONCARDIO-/CEREBROVASCULARDISEASE

April

2007

Vo1.5

No.4

达或仅少量阳性表达

,

与文献报道基本一致

[6,7]

。而模型组大

鼠脑组织

MMP-2

、

MMP-9

表达均较假手术组对应区域显著

升高

,

其中尤以缺血侧大脑为甚

;

此与

Rosenberg

等

[8]

用细胞培

养及免疫组化检测的结果基本一致。这表明

MMP-2

、

MMP-9

在缺血再灌注损伤中发挥了重要作用

,

结合模型组大鼠脑组

织较假手术组呈明显水肿改变及

MMP-2

、

MMP-9

本身生物

学功能

,

提示

MMP-2

、

MMP-9

参与损伤的部分机制是通过

降解

ECM

尤其血管基底膜、破坏血脑屏障、引起血管源性脑水

[9]

肿。新近国外有文献报道

,

在

MCAO

脑缺血再灌注损伤中检

测到

MMP-2

、

MMP-9

明显升高的同时伴有Ⅳ型胶原、层黏

蛋白等

ECM

含量的下降

,

这为上述推论提供了证据。

本研究显示

,

脑心通治疗组大鼠缺血再灌注后其组织学损

伤较模型组明显减轻

,

这说明脑心通对大鼠缺血再灌注后脑损

伤有保护作用。与此同时

,

相应的

MMP-2

、

MMP-9

表达也

较模型组显著降低则进一步提示脑心通可能通过下调

MMP-2

、

MMP-9

表达这一机制来对抗缺血再灌注损伤而发挥其保护

作用的。而要完全证实则有待于进一步检测血脑屏障中Ⅳ型胶

原、层黏蛋白和纤维连接蛋白等

ECM

的变化。

近几年临床和动物实验的研究发现

,

脑梗死急性期

,

除病灶

侧外

,

在远离病灶的部位也出现血流及代谢的改变

,

临床上则表

现为各种不同类型的神经机能联系不能

,

其形成机制目前认为

可能与血流动力学改变及神经传导通路的抑制有关

,

但具体确

切机制尚不明。

Lzumi

等

[10]

采用

MCAO

模型动态观察大脑中

动脉阻塞后

3h

、

6h

、

9h

和

24h

冠状位大脑

MRI

的信号

,

发现

MRI

异常信号的出现除分布在

MCA

供血区外

,

还涉及同侧大

脑半球

MCA

供血区之外的海马、梨状叶以及对侧大脑半球

,

并

提示远隔部位异常信号为水肿。这表明

MCAO

模型可用于研

究神经机能联系不能且脑水肿可能是其病理变化之一。

Heo

等

[11]

曾对

27

例非人类灵长类动物

MCA

缺血再灌注后

,

缺血区

及非缺血区基底核进行了冰冻组织切片和血浆标本

MMP-2

、

MMP-9

的检测

,

结果显示二者均有局部表达及血浆水平的升

高。本实验结果显示模型组大鼠非缺血侧脑组织较假手术组有

轻度水肿

,

且

MMP-2

、

MMP-9

表达显著高于假手术组

,

与上

述

Heo

等

[11]

结果较一致

,

进一步提示

MMP-2

、

MMP-9

可能

是通过引起脑水肿参与了局灶性脑梗死继发全脑损害的形成机

制

,

继而临床上表现出神经机能联系不能。脑心通治疗组大鼠

非缺血侧脑组织的组织学改变及

MMP-2

、

MMP-9

表达则与

假手术组无差异

,

这表明脑心通可通过抑制远隔部位脑组织

MMP-2

、

MMP-9

过度表达减轻远隔部位脑水肿进而减轻神

经机能联系不能。

脑心通通过抑制脑组织

MMP-2

、

MMP-9

的表达不仅可

减轻病灶组织的脑缺血再灌注损伤而且可减轻远隔部位脑水

肿

,

表明脑心通治疗作用之外尚存在全脑的保护作用。

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:624-633.

作者简介

:

余锋

,

现工作于安徽医科大学附属省立医院

(

邮编

:230001

)

;

胡向阳、董六一

,

工作于安徽医科大学

;

王文静、李淮玉、任明山

,

工作于

安徽医科大学附属省立医院。

(

收稿日期

:2007-01-08

)

(

本文编辑郭怀印

)

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