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2024年12月29日发(作者：二维数组的行列怎么表示)
Western blot
一、试剂配制
1）细胞裂解液：
组分：Tirs-base（50mM），EDTA（10mM），Nacl（100mM），Triton-100（1%）
Tirs-base
0.3025g
EDTA
0.146g
Nacl
0.2925g
Triton-100
0.5ml
用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。
2）PMSF：PMSF 0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，
此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。PMSF严重损害呼吸道
粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，
应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定，应
在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于
4℃。pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），
这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
3）1.5M Tris-base PH8.8：Tris-base 18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至
96ml，调PH时约需4ml浓HCL。
4）0.5M Tris-base PH6.8：Tris-base 6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，
调PH时约需3ml浓HCL。
5）10%SDS：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解
时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。
6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃
保存。注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙
烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中
应穿好实验服，注意防护。
7）考马斯亮蓝G250工作液：
考马斯亮蓝G250
0.01g
无水乙醇
5ml
磷酸
10ml
用双蒸水定容至100ml，过滤4℃保存。
8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA 0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀
释为1mg/ml工作液。
9）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）：
组分：1MTris-base PH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基
乙醇（5%）
1MTris-base PH6.8
1.25ml
甘油
2.5ml
SDS
0.5g
溴酚蓝
0.0025g
用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每
小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。
10）TBST缓冲液：
Tris-base
3g
Nacl
8g
Tween-20
1ml
用双蒸水定容至1000ml，调PH为7.4,4℃保存。
11)10%过硫酸铵（APS）：APS0.1g溶于1ml双蒸水中，4℃保存一星期有效，最好现配现用。
12)10%浓缩胶（7.5ml/两块胶）：
双蒸水
2.85ml
1.5MTris-base
PH8.8
1.9ml
10%SDS
75ul
10%过硫酸
铵（APS）
75ul
TEMED（毒） 30%Acry/bis
（毒）
5ul 2.6ml
依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。
13）5%浓缩胶（5ml/两块胶）：
双蒸水
2.1ml
0.5MTris-base 10%SDS
PH6.8
0.38ml 30ul
10%过硫酸
铵（APS）
30ul
TEMED（毒） 30%Acry/bis
（毒）
3ul 0.5ml
依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。
14)电泳缓冲液：
Tris-base
1.515g
甘氨酸
9.4g
SDS
0.5g
用双蒸水定容至500ml，由于SDS溶解过程中会产生泡沫，因此定容之后再加，现配现用。
15）转移缓冲液：
Tris-base
3.03g
甘氨酸
14.4g
甲醇
200ml
制胶完成后配制，用双蒸水定容至800ml，然后放入4℃冰箱预冷，使用时再加入200ml
甲醇。
16）5%牛奶封闭液：伊利脱脂奶粉0.5g，TBST10ml，4℃保存，最好现配现用。
二、组织蛋白提取
1）吸取792ul细胞裂解液与8ulPMSF，充分混匀置于匀浆器里放在冰上备用。
2）打开4℃低温高速离心机，预冷。
3）称取0.05g组织样品于匀浆器中，然后加入匀浆器中研磨。
4）将匀浆液移入2mlEP管中，冰上裂解30min。
5）1,2000r/min，4℃离心15min，取上清即为蛋白，放入-80℃保存。
三、蛋白浓度测定
空白管
标准管
待测管
CBB
2.4ml
2.4ml
2.4ml
双蒸水
40ul
-
36ul
1mg/mlBSA
-
40ul
-
蛋白样品
-
-
4ul
蛋白样品浓度=10×蛋白样品OD值/标准蛋白OD值，单位为ug/ul。
四、蛋白灭活
根据浓度计算出上样50ug蛋白所需体积分装于0.5mlEP管中，然后加入1/4体积的5×SDS
凝胶上样缓冲液，95℃高温煮沸5min，-80℃保存，最好现配现用，可临时于-20℃保存。
五、Western blot操作过程
1）制胶：将制胶板固定好，按上述方法配好分离胶，充分混匀后倒入制胶板中，确保胶不
漏，然后用双蒸水封闭，室温静置30min（配制电泳缓冲液及转移缓冲液），凝固后倒出双
蒸水，用滤纸吸干，配置好浓缩胶，倒入制胶板中，然后插入梳子，室温静置30min（灭活
蛋白）备用。
2）电泳：组装好电泳仪，红对红黑对黑，从密封的中间区域倒入电泳缓冲液，至漫过周边
下方的金属丝，然后拔出梳子，加入蛋白样品及蛋白Maker。插上电源，浓缩胶区域电压设
为60V（约30min），分离胶区域电压设为100V(约1h)，具体时间根据Loading Buffer把握。
3）转膜：将预冷后的转膜缓冲液中加入200ml甲醇混匀后倒置在托盘中，裁剪4张稍微小
于转膜海绵的滤纸，于转膜液中浸泡15min，同时取出胶，切割目的胶片段，置于转膜液中，
裁剪与之大小相同的NC膜于转膜液中浸泡15min。将转膜夹板置于托盘中，白色板在下，
依次放置：白色夹板—海绵—2层滤纸—NC膜—胶—2层滤纸—海绵—黑色夹板。将夹板
固定好后放入转膜槽中黑对黑白对红，接通电源，电压为100V，电流为250mA，时间为2h。
注：转膜过程在冰里操作。
4）封闭：将NC膜取出，在Maker端剪个小角，与胶接触面标记为上，然后置于10ml 5%
牛奶封闭液中，室温振荡摇匀1h。
5）洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。
6）一抗孵育：按1:1000比例用5%牛奶封闭液配制一抗GAPDH10ml，4℃振荡摇匀过夜。
或室温振荡2h，4℃过夜，一抗可回收重复利用。
7）洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。
8）二抗孵育：按1:5000比例用牛奶封闭液配制二抗10ml，室温振荡摇匀1h。
9）洗膜：TBST洗膜三遍，每遍10min。
10）ECL显色：取A液与B液各500ul即为ECL显色液（1ml），混匀备用。暗室操作，所
需准备的物品包括：200ul枪及枪头、暗盒、X胶片、剪刀、镊子、卫生纸、小平皿。将NC
膜置于小平皿中，加入ECL显色液，关灯待观察有条带荧光后，取出置于暗盒中（避免气
泡），用剪刀裁剪X胶片压在NC膜上，关闭暗盒，压片10s（压片时间根据荧光亮度决定），
打开暗盒，取出X胶片放入显影液中2min，然后在水中清洗几遍，在放入定影液中2min。
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