大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究

大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究

孙建滨;曾令兵;张辉;孟彦;徐进;周勇;王芳;李瑞伟;刘秋凤

【摘 要】为探讨β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活大鲵虹彩病毒(Giant

salamander iridovirus,GSIV)的最适条件,研究了BPL对GSIV的灭活方法.采用终

浓度分别为0.025％、0.05％、0.1％、0.2％的BPL灭活细胞培养的GSIV,4℃条

件下分别灭活24 h、48 h、72 h、96 h,通过细菌培养、细胞培养、病毒核酸

PCR扩增以及鱼体感染试验进行灭活病毒的安全性检验,确定最适灭活条件.试验结

果表明,GSIV经终浓度为0.1％的BPL 4 ℃灭活处理72 h后可完全灭活病毒,灭活

病毒无细菌污染,接种对GSIV敏感的鲤上皮瘤细胞系(EPC)细胞无细胞病变效应

(CPE)出现,病毒主衣壳蛋白(MCP)基因特异性引物PCR反应未扩增出靶基因产物,

灭活病毒对健康大鲵的感染试验未出现疾病症状.灭活效果检测结果表明,与未灭活

GSIV相比较,最适灭活条件下的GSIV结构蛋白与抗原性未发生显著变化.结论显示

BPL可用来灭活GSIV,本研究确立了BPL灭活GSIV的最适条件,为大鲵虹彩病毒

细胞培养灭活疫苗研究奠定了重要基础.

【期刊名称】《淡水渔业》

【年(卷),期】2013(043)003

【总页数】6页(P66-71)

【关键词】大鲵(Andrias davidianus);虹彩病毒;β-丙内酯;灭活

【作 者】孙建滨;曾令兵;张辉;孟彦;徐进;周勇;王芳;李瑞伟;刘秋凤

【作者单位】华中农业大学水产学院,武汉430070;华中农业大学水产学院,武汉

430070;中国水产科学研究院长江水产研究所,武汉430223;中国水产科学研究院

长江水产研究所,武汉430223;华中农业大学水产学院,武汉430070;中国水产科学

研究院长江水产研究所,武汉430223;中国水产科学研究院长江水产研究所,武汉

430223;华中农业大学水产学院,武汉430070;上海海洋大学水产与生命学院,上海

201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306

【正文语种】中 文

【中图分类】S947.3

中国大鲵(Andrias davidianus)，俗名“娃娃鱼”，属于两栖纲(Amphibia)有尾

目(Caudata)隐鳃鲵科(Cryptobrachidae)，是现存个体最大的两栖动物，具有很

高的科研、药用、营养及经济价值［1］。随着大鲵人工养殖的规模不断扩大，集

约化程度不断提高，人工养殖大鲵的病害问题日渐突出［2-5］。近年来，因虹彩

病毒感染而引起的大鲵病毒病在我国大鲵主要养殖区域流行，呈现蔓延趋势，且死

亡率达到90%以上，最高可达100%，造成重大经济损失，严重威胁大鲵人工养

殖业发展［6-7］。目前人工养殖大鲵的虹彩病毒病缺乏有效的防控措施，迫切需

要开展大鲵虹彩病毒病疫苗研制与免疫预防技术研究。

在灭活疫苗制备技术中，常用的病毒灭活剂包括福尔马林与 β-丙内酯(β-

propiolactone，BPL)，其中BPL应用更加广泛［8-10］。BPL是一种杂环类化

合物(C3 H4O2)，对病毒具有很强的灭活作用，其作用机制是通过与核酸的嘌呤碱

基反应破坏核酸的结构达到灭活目的，但不直接作用于蛋白质，因此能使灭活的病

毒保持良好的免疫原性［11-12］。此外，BPL是一种弱致癌剂，但可水解生成对

人体无害的β-羟基丙酸［13-14］。本研究选用BPL作为大鲵虹彩病毒的灭活剂，

对细胞培养获得的大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus，GSIV)进行灭活

效果研究，首次确定了BPL对GSIV病毒灭活的最适条件，为制备大鲵虹彩病毒

病细胞培养灭活疫苗奠定了重要前期基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病毒和细胞系

GSIV由本实验室分离鉴定与保存［15］。鲤上皮瘤细胞系(EPC)从武汉大学中国

典型培养物保藏中心获得，保藏号为CCTCCGDC0174。

1.1.2 试剂和仪器

BPL(SERVA，33672.01);MEM培养基(Hyclone，SH30024.01B);胰蛋白酶

(AmRESCO，0458);血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，新生牛血清)等;生

物安全柜(ESCO，ClassⅡBSC，Singapore);离心机(Sigma，3K-15，Germany);

化学发光成像与分析系统(BiO-RAD，ChemiDocTM XRS+ ，USA);PCR 仪

(Biometra，T-professional，Germany);小型垂直电泳槽(BiO-RAD，Mini-

PROTEAN○R Tetra System);半干转印电泳仪(BiO-RAD，Trans-Blot○R SD

Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell);细胞培养箱(SANYO，M IR-153)

1.1.3 引物设计

根据GenBank中蛙虹彩病毒主要衣壳蛋白编码基因(MCP)序列(AY294406)，应

用Primer 5.0软件设计特异性引物P1/P2。P1:5'-GACTTGGCCACTTATGAC-

3';P2:5'-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3'，该引物由上海生工生物技术有限公司合

成。PCR扩增长度为531 bp，扩增片段已测序并提交至GenBank中，序列号为

(JN099267)。

1.2 病毒培养及滴度测定

1.2.1 病毒培养

使用T-75 cm2细胞培养瓶(Corning，USA)将EPC细胞培养至汇合单层，吸弃培

养液，取细胞培养的GSIV病毒液，以感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)

为0.5的接种量感染细胞，置于25℃培养箱中吸附1 h，期间每20 min轻轻摇晃

培养瓶数次。1 h后，吸弃病毒液，加入含2%新生牛血清的MEM细胞培养液，

置于25℃培养箱中培养，逐日观察细胞病变情况。当细胞单层出现大约75%细胞

病变效应(Cytopathic effect，CPE)时，收获细胞培养物，置于－80℃保存备用。

使用前冻融3次后，于4℃条件下4 500 r/min离心30 min，收集上清，进行病

毒滴度(TCID50/0.1mL)的测定。

1.2.2 病毒滴度测定

于1.5 mL无菌离心管中用不含血清的MEM培养基将病毒液作10倍系列稀释，

将稀释好的病毒液分别接种于96孔微量培养板(Corning，USA)中，每个稀释度

接种8孔，每孔100μL，然后在每孔中加入细胞浓度为(2～3)×105个/mL的细胞

悬液100μL。设正常细胞对照8孔，每孔加入100 μL细胞培养液和100μL细胞

悬液。于25℃培养箱中培养，逐日观察CPE，按Reed-Muench法计算病毒滴度

(TCID50/0.1 mL)［16］。

1.3 病毒灭活

1.3.1 BPL灭活时间的确定

在GSIV病毒液中加入终浓度为0.1%的BPL，混合震荡均匀，置4℃冰箱分别灭

活处理24 h、48 h、72 h、96 h后，于37℃水浴去除残留BPL。以MEM培养

基中加入终浓度为0.1% 的BPL为阴性对照，以不加灭活剂的GSIV病毒液为阳性

对照。将上述样品分别接种EPC细胞，并盲传三代，观察CPE。

1.3.2 BPL灭活浓度的确定

在GSIV病毒液中分别加入终浓度为0.025%，0.05%，0.1% 和0.2%的BPL，混

合震荡均匀，置4℃冰箱灭活处理72 h后，于37℃水浴去除残留BPL。以MEM

培养基中分别加入终浓度为0.025%，0.05%，0.1% 和0.2%的BPL为阴性对照，

以不加灭活剂的GSIV病毒液为阳性对照。将上述样品分别接种EPC细胞，并盲

传三代，观察CPE。

1.4 安全性检验

1.4.1 无菌检验

将上述灭活的GSIV接种于固体LB培养基平板内，37℃培养箱培养10 d，观察有

无细菌生长。

1.4.2 细胞感染试验

将灭活的GSIV病毒液分别接种于EPC细胞，观察CPE。将未出现细胞病变效应

的细胞冻融3次后再于EPC细胞上盲传三代，每代培养7 d，逐日观察细胞病变

情况，确定BPL灭活GSIV病毒的最适灭活时间和最适灭活浓度。

1.4.3 鱼体感染试验

将实验室暂养1周后的健康大鲵(规格12～15cm)随机分成 3组，每组 30尾。试

验组以0.2 mL/尾的剂量采用腹腔注射途径注射完全灭活的GSIV病毒疫苗，以

0.2 mL/尾的剂量腹腔注射PBS作为阴性对照组，阳性对照组以0.2 mL/尾的剂量

腹腔注射GSIV病毒。每天观察记录死亡情况。

1.5 灭活效果检测

1.5.1 PCR核酸检测

用病毒DNA提取试剂盒(Promega，USA)提取灭活GSIV的核酸，以未灭活病毒

同步提取的核酸和阳性样品核酸为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，进行PCR扩增。

PCR反应条件:95℃预变性5 min后，95 ℃变性40 s，52 ℃ 退火 40 s，72 ℃延

伸40 s，40个循环，72℃延伸10 min。取PCR反应产物，琼脂糖凝胶电泳观察

扩增结果。

1.5.2 灭活GSIV结构蛋白SDS-PAGE分析

约35 mL灭活的GSIV经25 000 r/min 4℃超速离心2 h(Beckman-coulter，

SW28)，100μL PBS悬浮病毒沉淀，按体积比1:1加入2×Loading Buffer，添加

1μLβ-巯基乙醇后于沸水中煮沸10 min裂解病毒，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳

(Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，

比较分析BPL对GSIV结构蛋白的影响。

1.5.3 灭活GSIV抗原蛋白Western Blot分析

将进行SDS-PAGE电泳后的胶于电转缓冲液中孵育40 min，在转印电泳仪上将病

毒蛋白转移至硝酸纤维素膜上，参照金斯瑞ONE-HOUR WesternTM试剂盒

(ONE-HOUR WesternTM Standard Kit(Rabbit)，L00204C)说明书操作，室温

下于摇床上用pretreat solution孵育硝酸纤维素膜5 min，洗膜两次后，室温下

于摇床上用预先制备好的mixture1(WB-1 Solution和本实验室制备的GSIV多克

隆抗体)和WB-2将膜在混合液中孵育40 min，洗膜三次后用

Chemiluminescent HRP底物显影工作液室温下孵育3 min后显色观察结果。

2 结果与分析

2.1 病毒培养及滴度

GSIV病毒接种EPC细胞36 h后，细胞出现收缩、脱落现象，72 h后超过75%

的细胞出现CPE，单层细胞呈破网状。GSIV滴度经Reed-Muench法计算结果

为:TCID50/0.1 mL=108.83。

2.2 无菌检验结果

将灭活的GSIV接种于固体LB培养基平板内，37℃培养箱培养10 d后，观察发

现平板内并无细菌生长，确定灭活的GSIV无细菌污染。

2.3 BPL最适灭活时间

从表1可以看出，当BPL终浓度为0.1%时，不同灭活时间的GSIV病毒分别接种

至EPC细胞培养瓶，培养3 d后观察可发现，灭活处理24 h和48 h的GSIV病

毒仍具感染性，随着灭活时间延长至72 h和96 h时，则能使GSIV病毒失活，灭

活病毒接种细胞后未出现CPE，并盲传3代，每代细胞仍生长良好，未出现CPE。

说明GSIV病毒经终浓度为0.1%的BPL，灭活处理72 h或96 h可达到完全灭活

病毒的目的。为了缩短灭活周期，BPL最适灭活时间为72 h。

表1 不同灭活时间0.1%BPL灭活GSIV的细胞感染试验Tab.1 Infection test in

EPC cell of GSIV inactivated for different inactivation durationsw ith

0.1%BPL注:+++为未传代即检测到病毒;++为第一次盲传后检测到病毒;+为第二

次盲传后检测到病毒;－为三次盲传均未检测出病毒。下表同。___组别24 h 48 h

72 h______96 h 1++++++－ －2+++++－－3+++++－－

2.4 BPL最适灭活浓度

灭活时间设定为72 h，不同终浓度BPL灭活GSIV的细胞感染试验结果如表2所

示。由表可知，灭活时间为72 h，能使GSIV病毒失活的BPL有效终浓度为0.1%

和0.2%。而BPL浓度为0.025%和0.05%时，均不能完全灭活GSIV病毒。为了

减少BPL剂量，BPL最适终浓度为0.1%。

表2 不同终浓度BPL灭活GSIV 72 h后的细胞敏感试验Tab.2 Infection test of

GSIV inactivated w ith______different final concentrations of BPL at 72 h组

别 BPL终浓度/%0.025________0.05 0.1 0.2 1++++++－ －2++++++－ －

____3_______+++++－－

2.5 鱼体感染结果

未灭活GSIV注射感染健康大鲵在第3天大鲵体表出现出血点，第4天开始出现了

大鲵死亡，10天内累积死亡率达到了100%。死亡大鲵的症状与自然发病的症状

基本相同，且从人工感染病鲵体内再次分离到相同的病毒。GSIV灭活试验组和

PBS对照组在整个试验期间均未出现患病症状或死亡。

2.6 病毒核酸PCR扩增结果

当BPL终浓度为0.1%，灭活时间分别为24 h和48 h后，灭活病毒核酸的PCR

反应可扩增出与预期大小一致的产物(530 bp)(图1，Lane 2，Lane 3)，说明病毒

灭活不彻底;0.1%BPL灭活GSIV 72 h和96 h后，灭活病毒核酸的PCR扩增反应

未检测出病毒核酸靶基因(图1，Lane 4，Lane 5)，证明 GSIV被彻底灭活。当

BPL终浓度分别为0.025%和0.05%灭活时间为72 h时，灭活病毒核酸的PCR反

应可扩增出与预期大小一致的产物(530 bp)(图1，Lane 6，Lane 7);但当BPL终

浓度增加为0.1%和0.2%时，灭活72 h均可达到完全灭活GSIV的目的，灭活病

毒核酸的PCR扩增反应未检测出病毒核酸靶基因(图1，Lane 8，Lane 9)。灭活

病毒核酸检测的阴性对照(蒸馏水)未扩增出病毒核酸产物(图1，Lane 1)，未灭活

病毒的阳性对照可扩增出与预期大小一致的病毒核酸靶基因(图1，Lane 10，

Lane 11)。

表3 GSIV病毒疫苗对大鲵的人工感染试验结果______________________Tab.3

Results of artificial infection of GSIV vaccine in giant salamanderGSIV 30

0.2 0 0 0 0 0 0 0 0 PBS 30 0.2 0 0 0 0 0 0 0 0_未灭__活/%灭活组别 感染数量

剂量/mL 不同时间大鲵死亡数量4 d________5 d________6 d________7 d 8 d 9 d

10 d 死亡率GSIV_________30 0.2 1 4 4 8 7 5 1 100%

图1 GSIV病毒灭活处理后的PCR鉴定Fig.1 PCR identification for inactivated

GSIVM:DNA marker;1:阴性对照(水);2～5:β-丙内酯终浓度为0.1%，灭活时间分

别为24 h、48 h、72 h和96 h;6～9:灭活时间为72 h，β-丙内酯终浓度分别为

0.025%、0.05%、0.1%和0.2%;10:阳性病毒对照;11:阳性核酸对照。

2.7 灭活GSIV结构蛋白SDS-PAGE分析

GSIV于4℃条件下经终浓度为0.1%的BPL灭活处理72 h后，经离心浓缩与煮沸

裂解后进行SDS-PAGE电泳，灭活病毒主衣壳蛋白(MCP，分子质量约66 kDa)与

未灭活GSIV的MCP蛋白差异不明显，表明BPL灭活GSIV后对病毒的主要结构

蛋白影响不显著(图2)。

2.8 W estern Blotting抗原性分析

灭活GSIV蛋白的Western Blotting结果如图3所示。由图可以看出，经终浓度

为0.1%的BPL 4℃灭活处理72 h后的GSIV其主衣壳蛋白仍可以与GSIV多克隆

抗体发生特异性结合，说明灭活的GSIV其主要抗原蛋白仍保持了其良好的抗原性

与反应原性。

图2 GSIV灭活疫苗SDS-PAGE分析Fig.2 Structural protein of inactivated

GSIV by SDS-PAGEM:蛋白分子质量标准;1:GSIV;2:GSIV灭活疫苗

图3 GSIV灭活疫苗Western Blot分析Fig.3 Western Blotting analysis of

inactivated GSIVM:蛋白分子质量标准;1:GSIV;2:GSIV灭活疫苗

3 讨论

安全性检测是评价病原灭活效果与最适灭活条件最为直接的方法。本研究通过灭活

病毒的安全性检验，确定了BPL灭活GSIV的最适条件。GSIV经终浓度为0.1%

的BPL于4℃条件下灭活72 h后，GSIV丧失了对敏感细胞EPC以及健康大鲵的

感染性和致病性。这一结果与冯若飞等［17］的研究结果有差异，冯若飞等采用

终浓度为0.05%的BPL于4℃灭活8 h即可灭活滴度为103 TCID50的脑心肌炎

病毒。造成这一差异的原因可能是脑心肌炎病毒滴度相对于GSIV病毒滴度偏低，

且脑心肌炎病毒是一种无囊膜的单股正链RNA病毒［18］，BPL无需通过囊膜即

可作用于病毒核酸。而GSIV病毒是一种有囊膜的双链DNA病毒［19］，灭活过

程中BPL需先通过病毒囊膜再作用于病毒核酸结构。病毒PCR核酸检测实验结果

显示针对GSIV-MCP设计的特异性引物未扩增出靶基因产物，说明BPL在灭活过

程有效的破坏了病毒的核酸结构，这与徐守振［20］等指出 BPL的灭活机制是作

用于病原体DNA或RNA这一观点一致。

病毒的灭活，应使其失去感染性、毒性和增殖能力，但不应破坏病毒的主要结构蛋

白或抗原性。好的灭活方法应在失去病毒致病力的同时又保持其良好的免疫原性

［21］。灭活 GSIV结构蛋白的SDSPAGE分析结果显示，GSIV于4℃条件下经

终浓度为0.1%的BPL灭活72 h后，灭活GSIV和未灭活GSIV的病毒结构蛋白条

带相比较，其GSIVMCP仍保持了较好的完整性，说明BPL对病毒蛋白结构破坏

作用较弱。这一结果与Perrin等［12］的研究结果一致，他们认为BPL主要通过

直接作用病毒核酸从而达到灭活病毒的目的。Western Blotting的结果亦显示灭

活的GSIV仍能与针对GSIV的多克隆抗体发生特异性结合，进一步证明了GSIV

病毒经BPL灭活后仍保持了病毒良好的抗原性。

本研究中采用终浓度为0.1%的BPL于4℃条件下灭活72 h后，转入37℃中水解

去除残留BPL，即可消除灭活病毒中残留的BPL。大鲵病毒性出血病是近几年由

GSIV引起的严重疾病，对该病疫苗的研究尚属起步阶段。本研究首次确定BPL灭

活GSIV的最适条件，为大鲵虹彩病毒病疫苗制备以及免疫预防技术的研究奠定了

重要基础。

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