核酸等温扩增产物检测方法的研究进展

第35卷第3期2019年3月科技通报Vol．35No．3Mar．2019BULLETINOFSCIENCEANDTECHNOLOGY核酸等温扩增产物检测方法的研究进展叶摘璟，朱慧（浙江省科技信息研究院智江南，杭州310006）要：核酸等温扩增技术是二十世纪九十年代以来发展起来的一种新技术，相比于需要温度调制的传统核酸扩增技术，核酸等温扩增技术具有设备简单、操作方便等一系列优点，有实际应用价值。本文对核酸等温扩增产物（扩增子）的检测方法作一综述，并对今后的应用研究方向进行了初步探讨。关键词：核酸扩增；等温；扩增子；检测中图分类号：TS201.6文献标识码：A文章编号：1001－7119（2019）03－0215－04DOI：10.13774/j．cnki．kjtb．2019.03.042ＲesearchProgressintheDetectionMethodsofIsothermalNucleicAcidAmplificationAmpliconsYeJing，ZhuHui（ZhejiangScienceandTechnologyInformationＲesearchInstitute，ZhejiangThinkTank，Hangzhou310006，China）Abstract：Isothermalnucleicacidamplificationisanewtechniquedevelopedsince1990’s．Comparedwithtraditionalnucleicacidamplificationtechniqueswhichneedtemperaturemodulation，isothermalnucleicacidamplificationtechnologyhasaseriesofadvantagessuchassimpleequipmentandconvenientoperation．Italsohaspracticalapplicationvalue．Themajordetectionmethodsforisothermalnucleicacidamplificationampliconsarereviewedinthispaper．Meanwhile，thefutureresearchdirectionofapplicationispreliminarilydiscussed．Keywords：nucleicacidamplification；isothermal；amplicons；analysis采用分子生物学方法在核酸层面进行的检测具有特异性好、灵敏度高等优点。实时荧光定量PCＲ发展。与PCＲ扩增方法相比，等温扩增最突出的优势在于可以在较低的温度下获得单链模板以实现核酸快速持续扩增。因此等温扩增技术不需要引入温度循环，在某一特定的温度下就能实现对目标基因［2］的扩增放大。由于扩增反应的全过程均在恒定温度下进行，对仪器的要求简化，可通过电热板、水浴槽、保温杯等简单，甚至非专业设备完成反应，反应时间也大大缩短，因而更能满足食品安全检测中“快速、简便”的需求，具有重要的实际应用价值。若是和传统PCＲ方法一样，采用复杂的荧光系统对（polymerasechainreaction，聚合酶链反应）因具有特异灵敏、定量准确、重复性好等优点在食品安全检测、基础科学研究、医学诊断等领域得到广泛应［1］用。但是，目前各种实时荧光定量PCＲ检测仪器以实验室应用为主，无法在现场实现致病菌等的快速筛查和检测。20世纪90年代以来，无需热变性的核酸等温扩增技术（isothermalnucleicacidamplification）得以收稿日期：2018－04－12基金项目：国家自然科学基金项目（31571918）资助。作者简介：叶璟（1973－），女，硕士研究生，副研究员，主要研究方向为科技信息研究和科技管理。

216科技通报第35卷核酸等温扩增产物（扩增子）进行检测，则等温扩增的优势将大大削减。因此，人们进行了大量的研究，对等温核酸扩增产物进行检测。本文主要对核酸等温扩增产物的检测方法作一综述。1核酸等温扩增技术的分类目前，比较成熟的核酸等温扩增技术根据不同的单链形成方式，大致可以分为以下四类：链置换DNA聚合酶介导的扩增反应，酶促解旋/引物退火的扩增反应，单链剪切酶辅助的扩增反应和基于ＲNA转录的反应。（1）链置换DNA聚合酶介导的扩增反应，如环介导核酸扩增技术（loop-mediatedisothermalAmplification，LAMP）［3］、交叉引物技术（cross-primingamplication，CPA）［4］、以及滚环扩增技术（rollingcircleamplification，ＲCA）［5］等。这类方法主要通过特殊的引物设计以及具有链置换功能的DNA聚合酶在常温条件下形成单链，从而产生新的引物结合位点，引发新一轮的扩增。（2）酶促解旋/引物退火的扩增反应，如重组酶介导扩增（recombinasepolymeraseamplification，ＲPA）［6］，依赖解旋酶的扩增（helicase-dependentamplification，HDA）［7］。这类方法通过使用解旋酶对双链DNA进行解旋或是重组酶－引物复合物特异性识别双链DNA上的目标序列并促进引物与模板序列结合，进而实现扩增。（3）单链剪切酶辅助的扩增反应，如切刻内切酶介导的扩增（nikingenzymeamplificationreaction，NEAＲ）［8］以及链替代扩增（stranddisplacementamplification，SDA）［9］，这类方法主要利用限制性内切酶或是切刻内切酶结合DNA。总的来讲，这些扩增技术通过特殊设计的引物序列或是特殊功能的酶进行辅助在常温条件下不断形成新的引物结合位点，保证扩增反应的持续进行。（4）基于ＲNA转录的反应，如依赖核酸序列等温扩增（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）［10］和转录介导的扩增（transcription-mediatedamplification，TMA）［11］等。NASBA的扩增反应由两种特别设计的特异性寡核苷酸引物介导，AMV逆转录酶、噬菌体T7ＲNA多聚酶、核糖核酸酶H三种酶催化而完成。NASBA的技术原理与TMA基本一致，不同之处在于TMA利用的是T7ＲNA聚合酶和MMLV逆转录酶两种酶。2核酸等温扩增产物的光学检测方法目前，常用的核酸等温扩增检测方法有实时荧光法、免疫试纸条法、浊度法、比色法以及可视化荧光染料法。2.1实时荧光法利用SYTO9、SYBＲGreenI等荧光染料能够与双链DNA特异性结合的特性，通过核酸扩增过程中的荧光强度变化来实时、定量地检测双链DNA的产量。该方法具有重复性高、能够定量、实时分析的特点，但需要复杂的荧光检测系统，在成本上不具有优势，不适合资源贫乏的地区。2.2免疫试纸条法免疫试纸条法是指经过标记的特异性扩增产物能够同时被质控线（C）和检测线（T）上的抗体捕获并显现为两条红色条带，而非特异性扩增的样品则仅仅显示为质控线（C）红色。根据试纸条结果能够进行半定量的核酸扩增检测，检测结果具有特异性，并能够同时检测多目标分子，但是该方法无法实时检测，并且需要借助其他一些装置防止核酸扩增结束后开盖可能造成的交叉污染，具有一定局限性。2.3浊度法［12］原理是核酸扩增过程中产生的焦磷酸根与溶液中的镁离子产生焦磷酸镁沉淀，随着反应进行，沉淀大量积累就会产生肉眼可见的浊度变化，因此该方法对扩增产物的产量要求比较高，主要用于环介导核酸扩增（LAMP）反应的检测，且为了避免肉眼判断出现误差，常需要进行离心，以便观察管底沉淀。使用小型浊度仪可以避免肉眼判断引起的误差，但价格比较昂贵，使得浊度法用于核酸检测受到一定限制。2.4比色法同样是利用核酸扩增反应中产生的焦磷酸根进行检测，最大优点是反应快、操作简单。其中应用最为普遍的是钙黄绿素法［13］。钙黄绿素是一种金属离子荧光指示剂，本身能发出绿色荧光，当反应溶液中同时添加锰离子和钙黄绿素时，锰离子与钙黄绿素结合能够猝灭其荧光。随着扩增反应的进行，不断产生的焦磷酸根竞争性与锰离子相结合，使得锰离子脱离钙黄绿素从而呈现绿色荧光。该方法的局限性主要是容易受到样品中其他金属离子的干扰造成误差。

第3期叶璟等．核酸等温扩增产物检测方法的研究进展2172.5可视化荧光染料法［14］指利用高浓度的SYBＲGreenI等荧光染料对核酸扩增反应进行指示。由于高浓度的SYBＲGreenI对双链解旋有抑制作用，影响核酸扩增的反应效率，因此无法进行闭管检测，往往在扩增反应结束后需要开盖添加染料，加大了交叉污染的风险。针对SYBＲGreenI需要开盖添加的问题，Zhou等事先将SYBＲGreenI滴加在反应管的管盖上，在反应进行完全后离心，将扩增产物与染料混合，无需开盖操作，有效避免了污染风险［15］，并在1个小时之内完成了转基因甘蔗cry1Ac基因的检测，检测限达到1ng/μL。此外，Karthik等将研发的染料胶囊应用于LAMP检测，SYBＲGreenI染料用注射器固定在琼脂糖胶囊内，在LAMP扩增期间（63℃，30min）这种染料胶囊不会融化；扩增结束后，于95℃加热5min琼脂糖凝胶即可融化、释放SYBＲGreenI染料，从而达到可视化荧光检测核酸扩增的目的［16］。3核酸扩增产物的电化学检测方法如第2节所述，目前大多数快速等温扩增检测方法仅限于终点分析，即在核酸扩增反应结束后对扩增产物进行分析。若需要对等温核酸扩增进行实时分析，仍多采用荧光光学方法。和荧光方法相比，电化学方法具有体积小、成本低等一系列优势。若能将核酸等温扩增和电化学检测相结合，将进一步促进仪器的小型化，使其能够便捷使用。电化学核酸检测方法主要利用嵌入式氧化/还原标记（intercalatingredoxreporter）来进行［17］。随着核酸扩增反应的进行，氧化/还原标记嵌入到生成的双链中，从而使得被检测到的电流变小。通过检测氧化/还原电流的变化，就能实现核酸扩增产物的实时检测。Mohanmed课题组先后采用不同的氧化还原探针，如Hoechst33258［18］、ＲuHex［19］、Os［（bpy）2DPPZ］（PF6）2）［20］等，根据各种染料的不同性质实现核酸扩增的终点检测或实时分析，并设计了相应的便携仪器。在采用氧化还原探针时，选择和双链扩增产物有合适亲和力的探针十分重要，Defever等人的研究表明，采用Os［（bpy）2+2DPPZ］分子作为探针可以得到最好的检测结果［21］。除了利用嵌入式氧化/还原标记外，英国帝国理工大学的Toumazou教授课题组［22］报道了一种利用氢敏感离子场效应管（ion-sensitivefield-effecttransistor，ISFET）对PCＲ扩增和LAMP等温扩增实时检测的方法。其基本思想是在核酸扩增过程中，当一个核苷酸被结合到链上时，就会释放出氢离子，从而造成溶液pH值的变化。这一方法的优点是在检测过程中不需要在溶液中加入任何标记物；同时，采用场效应管，也使得整个系统很容易集成、微型化。但是，这一方法的缺点是核酸扩增反应必须在很弱缓冲的溶液中进行。随着反应的进行，扩增也pH值会变化，而很多PCＲ反应的酶对扩增液的pH值都有一定的要求，从而限制了该方法的应用。Zhang等将pH检测这一思想应用于CPA扩增产物的检测，他们优化了扩增液的缓冲体系，并设计了专门的厚膜pH电极，实现了相关检测［23］。4结语核酸等温扩增技术是一种很有希望应用于现场检测的技术。为了避免传统核酸扩增子检测的复杂荧光检测系统，人们开展了大量的研究，也得到了一些有益的成果。总的来说，采用比色等检测方法，具有操作简单，使用方便的特点。但是，比色检测一般只能用于核酸扩增的终点检测，信息量较少。同时，在实际使用过程中，由于环境光线等因素的影响，比色检测也容易出现误判。采用电化学检测方法有可能实现核酸扩增过程的全程监测。和荧光检测系统相比，电化学检测十分方便，所需电极和仪器的成本也较低。但是，电化学检测还需要进一步优化电化学探针和双链扩增产物的亲和力，以保证既能得到较明显的电化学信号，又不会因为亲和力太强和抑制进一步的扩增。参考文献：1］王玉倩，薛秀花．实时荧光定量PCＲ技术研究进展及其应用［J］．生物学通报，2016，51：1－6．2］YX．Zhao，F．Chen，Q．Li，etal．Isothermalamplificationofnucleicacids［J］．ChemicalＲeviews，2015，115：12491－12545．3］T．Notomi，H．Okayama，H．Masubuchi，etal．Loop－mediatedisothermalamplificationofDNA［J］．NucleicAcidＲesearch，2000，28：e63．4］GLXu，L．Hu，HYZhong，etal．Crossprimingamplification：mechanismandoptimizationforisothermalDNAamplification［J］．ScientificＲeport，2012，2：246－252．5］PMLizardi，XHHuang，ZＲZhu，etal．Mutationdetectionandsinglemoleculecountingusingisothermal［［［［［

218科技通报第35卷rollingcircleamplification［J］．NatureGenetics，1998，19：225－232．［6］OPiepenburg，CHWilliams，DLStemple，etal．DNAdetectionusingrecombinationproteins［J］．PlosBiology，2006，4：1115－1121．［7］V．Myriam，Y．Xu，HMKong．Helicase－dependentisothermalDNAamplification［J］．EMBOＲeports，2004，5：795－800．［8］山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心．金黄色葡萄球菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒［P］．中国，CN102424836A，2012－04－25．［9］WalkerGT，LittleMC，NadeauJG，etal．IsothermalinvitroamplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymerasesystem［M］．ProcNatlAcadSciUSA，1992，89：392－396．［10］JCompton．Nucleicacidsequence－basedamplification［J］．Nature，2005，350：91－92．［11］CSHill．MoleculardiagnostictestingforinfectiousdiseasesusingTMAtechnology［J］．ExpertＲeviewofMolecularDiagnostics，2001，1：445－455．［12］Y．Mori，K．Nagamine，N．Tomita，etal．Detectionofloop－mediatedisothermalamplificationreactionbyturbidityderivedfrommagnesiumpyrophosphateformation［J］．BiochemicalandBiophysicalＲesearchCommunications，2001，289：150－154．［13］T．Norihiro，M．Yasuyoshi，K．Hidetoshi，etal．Loop－mediatedisothermalamplification（LAMP）ofgenesequencesandsimplevisualdetectionofproducts［J］．NatureProtocols，2008，3：877－882．［14］C．Wang，Ｒ．Li，S．Quan，etal．GMOdetectioninfoodandfeedthroughscreeningbyvisualloop–mediatedisothermalamplificationassays［J］．AnalyticalandBioanalyticChemistry，2015，407：4829－4834．［15］D．G．Zhou，J．L．Guo，L．P．Xu，etal．Establishmentandapplicationofaloop－mediatedisothermalamplification（LAMP）systemfordetectionofcry1Actransgenicsugarcane［J］．ScientificＲeports，2014，4：4912－4919．［16］K．Karthik，Ｒ．Ｒathore，P．Thomas，etal．Newclosedtubeloopmediatedisothermalamplificationassayforpreventionofproductcross－contamination［J］．MethodsX，2014，1：137－143．［17］A．Martin，K．Grant，F．Stressmann，etal．Ultimatesingle－CopyDNAdetectionusingreal-timeelectrochemicalLAMP［J］．ACSSensors，2016，1：904－912．［18］M．U．Ahmed，M．Saito，M．MHossain，etal．ElectrochemicalgenosensorfortherapiddetectionofGMOusingloop－mediatedisothermalamplification［J］．Analyst，2009，134：966－972．［19］M．Ahmed，S．Nahar，M．Safavieh，etal．Ｒeal－timeelectrochemicaldetectionofpathogenDNAusingelectrostaticinteractionofaredoxprobe［J］．Analyst，2013，138：907－915．［20］M．Safavieh，M．U．Ahmed，A．Ng，etal．High－throughputreal-timeelectrochemicalmonitoringofLAMPforpathogenicbacteriadetection［J］．BiosensorsandBioelectronics，2014，58：101－106．［21］T．Defever，M．Druet，D．Evrard，etal．Ｒeal－TimeelectrochemicalPCＲwithaDNAintercalatingredoxprobe［J］．AnalyticalChemistry，2011，83：1815－1821．［22］C．Toumazou，L．M．Shepherd，S．C．Ｒeed，etal．SimultaneousDNAamplificationanddetectionusingapH－sensingsemiconductorsystem［J］．NatureMethods，2013，10：641－647．［23］F．Zhang，J．Wu，Ｒ．Wang，etal．PortablepH－inspiredelectrochemicaldetectionofDNAamplification［J］．ChemicalCommunications，2014，50：8416－8419．