普洛麦格 RealTime-Glo

中 文 说 明 书

LDH-Glo™

Cytotoxicity Assay

适用产品目录号：

G9711, G9712 and G9713

J2380和J2381

2019

原英文技术手册

版 CTM548

TM548

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay

所有技术文献的英文原版均可在/ protocols 获得。请访问该网址以确定您使用的说明书是否为最新版本。如果您

在使用该试剂盒时有任何问题，请与Promega 北京技术服务部联系。

电子邮箱：*************************

1. 产品描述 ...................................................................................................................................................................2

2. 产品组分和储存条件 .................................................................................................................................................4

3. 实验前的准备 ............................................................................................................................................................5

3. A. 用户需提供的材料........................................................................................................................................... 5

3. B. 试剂准备..........................................................................................................................................................5

3. C. 检测线性范围和LDH稀释倍数的建议.............................................................................................................6

3. D. 温度和试剂兼容性 ...........................................................................................................................................7

3. E. 检测实验的孵育时间........................................................................................................................................7

3. F. 微孔板和设备 ...................................................................................................................................................7

4. 操作步骤 ...................................................................................................................................................................8

4. A. 推荐的对照 ..................................................................................................................................................... 8

4. B. 细胞毒性检测操作步骤示例 .............................................................................................................................8

4. C. LDH阳性对照 ...............................................................................................................................................10

5. 注意事项 ..................................................................................................................................................................11

5. A. 细胞培养基和血清..........................................................................................................................................11

5. B. LDH在培养基中和在冷冻状态下的稳定性 ....................................................................................................12

5. C. 使用终止液以获得稳定的发光信号 ................................................................................................................13

5. D. 与活力检测或其它检测试剂盒联合使用.........................................................................................................13

6. 附录 ........................................................................................................................................................................14

6. A. 检测球状体（SPHEROID）培养物中时间依赖性的细胞毒性 ........................................................................14

6. B. 在ADCC实验中检测细胞特异性的细胞毒性.................................................................................................15

6. C. 评估细胞数量和细胞增殖 ..............................................................................................................................16

6. D. 参考文献........................................................................................................................................................17

6. E. 相关产品........................................................................................................................................................17

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地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909技术支持电话：800 810 8133(座机拨打)，400 810 8133(手机拨打)

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1

1.

1. 产品描述

Description

Lactate dehydrogenase (LDH) is a soluble stable cytosolic enzyme present in many cell types that is rapidly released

into the cell culture medium upon disruption of the plasma membrane. LDH is a widely used marker in cytotoxicity

乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的可溶性胞质酶，存在于多种细胞中。当细胞质膜出现破损时，该酶会快速释放到培养基中。

studies.

因此，LDH是细胞毒性研究中广泛使用的一种标志物。

The LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay provides a simple bioluminescent method for quantifying LDH release. The bright

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay提供了一种简单的生物发光方法来定量LDH的释放。利用该方法得到的发光信号明亮、

luminescent signal provides the sensitivity to determine cytotoxicity in samples low in cell number such as 3D

灵敏度高，因而能够测定细胞数量较少的样品（例如：3D微组织球状体、微流体细胞培养芯片、原代细胞和干细胞）

microtissue spheroids, microfluidic cell culture chips, primary cells and stem cells.

中的细胞毒性。

In the LDH-Glo™ Assay protocol, LDH Detection Reagent (containing Lactate, NAD+, Reductase, Reductase

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay的检测方案为：将LDH检测试剂（含有乳酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD+]、还原酶、

Substrate and Ultra-Glo™ rLuciferase) is added to a sample of diluted cell culture media. If the sample contains LDH,

还原酶底物和Ultra-Glo™超稳萤光素酶）加入经稀释的细胞培养基样品中。如果样品中含有LDH，那么如图1所示的

the enzyme-coupled reactions shown in Figure 1 start and progress simultaneously. The luminescent signal generated is

proportional to the amount of LDH in the sample. The signal increases until all reductase substrate is consumed and

酶偶联反应将开始并同时进行。产生的发光信号与样品中LDH的含量成比例。发光信号会持续增强，直到所有还原酶

the reaction signal is no longer in the linear range of the assay.

底物消耗殆尽，反应信号不再处于本检测的线性范围之内。

Leaky Cell

LDH

Lactate

NAD

Reductase

Substrate

LDH

NADH

Reductase

Luciferin

Pyruvate

Ultra-Glo™ rLuciferase

+ ATP

Light

Figure 1. LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay principle. Lactate Dehydrogenase (LDH) catalyzes the oxidation of

lactate with concomitant reduction of NAD+ to NADH. Reductase uses NADH and reductase substrate to generate

luciferin, which is converted to a bioluminescent signal by Ultra-Glo™ rLuciferase. The light signal generated is

图1. LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay的原理。乳酸脱氢酶(LDH)催化乳酸氧化，同时NAD+还原为NADH。还原酶

proportional to the amount of LDH present.

利用NADH和还原酶底物生成萤光素（Luciferin），然后luciferin被Ultra-Glo™超稳萤光素酶转化，产生生物发光信号。

本过程中产生的发光信号与样品中LDH的含量成正比。

2

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操作步骤示意图：

Treat cells with test agents.

Remove 2–5µl of medium.

Dilute into Storage Buffer.

Measure immediately or

store at or below –20°C.

Add LDH Detection Reagent

at a 1:1 ratio.

Record luminescence

after 30–60 minutes.

图2. LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay操作步骤。为了检测从死细胞中释放出来的LDH，取出少量培养基(

2-5 μl

)，加

入LDH储存缓冲液中稀释（见第3.B节）。使用的稀释倍数（25-100倍）取决于细胞的数量以及培养基中是否存在血

清（见第3.C节的表1）。在已稀释的样品中加入等体积的LDH检测试剂，测定LDH的活性。

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2. 产品组分和储存条件

产品

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay

规格

10 ml

目录号

J2380

试剂盒里包含的试剂足够在96孔板中进行200次反应（50

μ

l样品 + 50

μ

l配制好的LDH检测试剂）。具体包括：

• 10 ml LDH Detection Enzyme Mix

• 55 μl Reductase Substrate

• 1

瓶

Lactate Dehydrogenase

产品

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay

规格

50 ml

目录号

J2381

试剂盒里包含的试剂足够在96孔板中进行1,000次反应（50

μ

l样品 + 50

μ

l配制好的LDH检测试剂）。具体包括：

• 50 ml LDH Detection Enzyme Mix

•

275 μl

Reductase Substrate

• 1瓶 Lactate Dehydrogenase

储存条件：将整个试剂盒在–65℃以下保存。或者，将Reductase Substrate在–65℃以下避光保存，其它组分在–30℃

至–10℃保存。试剂盒组分的冻融次数不要超过3次。

than thre

!

Us

在处理细胞、细胞培养试剂等生物危险品时，请使用个人防护设备，并遵守您所在机构的相关安全指南和操

wh

作要求。

4

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3.

than thr

实验前的准备

!

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在开始实验之前，

wh

请务必详细阅读整个操作步骤（第3、4节），以熟悉试剂盒的检测流程。

3.A. 用户需提供的材料

• 细胞和细胞培养基；

• LDH储存缓冲液（第3.B节；200mM Tris-HCl (pH 7.3)、10%甘油和1%牛血清蛋白）；

• 壁不透明且可与标准微孔板读数仪兼容的96孔或384孔板（底部透明或不透明）；

• 单通道和多通道移液器与吸头；

• 单通道和12通道的试剂槽；

• 具备读板功能的发光检测仪（例如，GloMax

®

Discover发光检测仪，目录号GM3000）；

• Triton X-100（可选）；

• 甲萘醌Menadione（可选）。

3.B. 试剂准备

LDH检测试剂

1. 室温下融化LDH Detection Enzyme Mix和Reductase Substrate。融化后，将LDH Detection Enzyme Mix平衡至

室温。Reductase Substrate应置于冰上。混匀融化后的组分，确保溶液在使用前保持均匀。

2. 在即将使用溶液之前，按照下表所示将LDH Detection Enzyme Mix和Reductase Substrate混匀，配制成LDH检

测试剂。表中给出的体积是以96孔板形式进行实验，每孔使用50

μ

l样品和50

μ

l LDH检测试剂。准备好实验

所需的足量试剂，注意在移液过程中可能会损失小量试剂。通常情况下，5 ml的检测试剂足以满足一块96孔板的

用量。

组分每孔反应(96孔板)每块96孔板

LDH Detection Enzyme Mix50 μl5 ml

Reductase Substrate0.25 μl25 μl

3. 将LDH检测试剂轻轻颠倒五次混匀。

注意：将未使用的LDH Detection Enzyme Mix储存于–65℃或–30℃至–10℃之间。将未使用的Reductase

Substrate置于–65℃以下避光保存。已配好的LDH检测试剂不可储存。

LDH储存缓冲液

使用储备溶液配制LDH储存缓冲液，使其最终浓度为：200 mM Tris-HCl (pH 7.3)，10%甘油和1% BSA（牛血清蛋白）。

LDH储存缓冲液在4℃保存，可用于稀释和冷冻样品。在培养基或PBS中冷冻的样品，其LDH活性会显著下降（详

见第5.B节）。

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3.C. 检测线性范围和LDH稀释倍数的建议

进行LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay时，取出一小部分的细胞培养基稀释到LDH储存缓冲液中，然后将其转移至检测

板中。所需的稀释倍数取决于样品中LDH的含量、培养基中是否存在血清，以及反应时间。稀释倍数须进行优化，以

适应本试剂盒的线性范围（图3）。

样品稀释倍数越低，检测灵敏度就越高。但当细胞数量较多或培养基中存在血清时（其中含有相当量的LDH），则需

要较高的稀释倍数以延长检测的线性范围。样品稀释的一般性建议见表1。

10

7

1:25

1:100

L

u

m

i

n

e

s

c

e

n

c

e

(

R

L

U

)

10

6

10

5

10

4

10

3

1101001,00010,000

Cells/Well

图3. LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay的线性范围取决于稀释倍数。在不含血清的F12培养基中裂解的A549细胞用

LDH储存缓冲液以1:25或1:100的比例稀释，并在室温下与等体积的LDH检测试剂一起温育60分钟，然后记录发光

信号。X轴上的Cells/Well（细胞/孔）表示稀释前的裂解细胞数量。在LDH-Glo™检测中使用的细胞数量稀释了25

倍和100倍。RLU = 相对发光单位。

表1. 设置LDH-Glo™ Assay时的稀释倍数建议

培养基成分细胞数/100

μl

< 1,000

不含血清

1,000-10,000

10,000-50,000

含10％血清

1,000-25,000

25,000-50,000

稀释倍数

5X

25X

100X

100X

300X

6

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3.D. 温度和试剂兼容性

发光信号的强度和稳定性对温度变化很敏感。为了获得一致的结果，请在使用试剂和样品前先将其平衡至室温(22-

25℃)。

避免待测样品中出现二硫苏糖醇（DTT）和其他还原剂。还原剂会与还原酶底物反应，因而增加背景。

3.E. 检测实验的孵育时间

加入LDH检测试剂30-60分钟后，记录发光信号。为了确保各种酶偶联反应达到平衡，不建议在加入试剂后30分钟

内读数。孵育时间超过60分钟将增加检测的灵敏度，但请务必确认检测结果仍在线性范围内，且发光信号在持续增强。

3.F. 微孔板和设备

本检测试剂盒可兼容大部分用于测量发光信号的标准发光检测仪。有些仪器不要求调整增益，但是出于灵敏度和动态

范围的考虑，其他仪器可能需要优化增益设置。每孔0.5-1秒的整合时间可作为参考。如想了解精确的仪器设置，请参

阅仪器手册。

请使用可与您的发光检测仪兼容的不透明、白色多孔板（例如，Corning Costar

®

#3917的96孔板或Costar

®

#3570

的384孔板）。在黑色板中发光信号会减弱，在透明板中，孔与孔之间发光信号的交叉干扰会增强。本说明书图中显

示的RLU（相对发光单位）值会随着用来生成数据的微孔板和发光检测仪的不同而改变。尽管相对发光值会随着仪器

的不同而变化，但是此类变化不会影响检测性能。

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4. 操作步骤

本方案在96孔板中操作时使用50

μ

l样品和50

μ

l LDH检测试剂。在该检测中样品和检测试剂的体积是可以调整的，

只要二者的体积比维持在1:1（例如，采用384孔板模式时，可使用12.5

μ

l样品和12.5

μ

l LDH检测试剂）。

than thr

在开始实验之前，请阅读整个操作方案以熟悉检测程序。

!

Us

wh

4.A. 推荐的对照

在每个检测板中都需设置推荐的对照，并按照与实验样品相同的方式来处理对照。

• 无细胞对照（No-Cell Control）：设置3个不含细胞的复孔作为阴性对照，用以测定培养基的背景。

• 仅含溶剂的细胞对照（Vehicle-Only Cells Control）：用未处理细胞设置3个复孔，作为溶剂对照。向溶剂对照孔

中加入溶解待测化合物所使用的相同溶剂。

• 最大LDH释放对照（Maximum LDH Release Control）（可选）：设置3个复孔用于测定最大LDH释放。向仅含

溶剂的细胞中加入10% Triton X-100（每100

μ

l添加2

μ

l），孵育10-15分钟或更长时间，然后收集样品用于LDH检测。

注意：只有在计算细胞毒性百分比时才需要用到此对照。

4.B. 细胞毒性检测操作步骤示例

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay可用于测定由细胞毒性药物或化合物处理后所引起的细胞死亡。检测可在单个时间点或

多个时间点进行。图4显示了通过从各个孔中重复取样来测量细胞毒性的实例。附录中提供的其他示例数据（图8和9）

显示了使用LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay来检测球状体（spheroid）培养物中时间依赖性的细胞毒性以及ADCC（抗

体依赖性细胞介导的细胞毒性作用）实验中的细胞特异性的细胞毒性。

1. 设置96孔检测板，板中含有培养基和细胞。留出不含细胞的孔作为阴性对照，用以测定培养基中LDH的背景发光。

2. 将待测化合物和仅含溶剂的对照添加到适当的孔中（详见第4.A节）。将处理过的检测板放回细胞培养箱培养至处

理结束。

3. 在所需的实验时间点收集培养基样品，方法是将2–5

μ

l样品转移到48–95

μ

l的LDH储存缓冲液（第3.B节）中。

上下移液2-3次（不接触或干扰细胞）使之混匀，确保样品均一。

注意：从孔中移除多达10%的初始培养基（例如，当培养基的初始体积为100

μ

l时，在4个时间点分别取走2.5

μ

l的培养基）不应影响剩余的细胞。相关示例请参见图4。应根据经验确定培养基的移除对具体实验系统的影响。

可选方案：如需最大LDH释放对照，则向仅含溶剂的细胞孔中添加2

μ

l的10% Triton X-100（每100

μ

l初始体

积），混匀并孵育至少10-15分钟后取样。

4. 收集并稀释完所有样品后，执行步骤5的操作，或将样品保存在<–20℃，以备将来检测。

5. 在检测当天，将冷冻样品融化，并将其在LDH储存缓冲液中稀释（如果需要）以便匹配试剂盒的线性范围。样品

than thr

稀释的一般性建议如表1所示。

!

确保样品平衡至室温

Us

(22-25℃)，然后再进行步骤6的操作。

wh

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6. 将50

μ

l已稀释的样品转移至壁不透明的96孔板中（底部透明或不透明）。

7. 向每个孔加入

!

50

μ

l的LDH检测试剂（配制方法如第3.B节所述）。

8.

than thr

室温(22-25℃)孵育60分钟。

检测试剂30-60分钟后，记录发光信号。为了确保各种酶偶联反应达到平衡，不建议在加

!

Us

注意：在添加LDH

入试剂后

wh

30分钟内读数。孵育时间超过60分钟会增加检测的灵敏度，但请务必确保检测结果仍在线性范围

内，且发光信号在持续增强。

9. 记录发光信号（参见第

!

3.F节）。

10. 如果需要，可计算细胞毒性百分比（% 细胞毒性）：

（实验组LDH释放- 培养基背景）

细胞毒性%= 100 ×

（最大LDH释放对照- 培养基背景）

(Maximum LDH Release Control – Medium Background)

A.B.

1 × 10

7

4 hours

140

4 hours

24 hours

24 hours

8 × 10

6

)

U

105

L

R

y

t

(

i

e

c

c

6 × 10

6

i

x

n

o

e

t

70

c

o

s

t

e

n

4 × 10

6

y

C

i

m

%

u

35

L

2 × 10

6

0

0

–1.0–0.50.00.51.01.52.02.53.0

–1.0–0.50.00.51.01.52.02.53.0

log [Digitonin], µg/ml

log [Digitonin], µg/ml

4 hours24 hours

4 hours24 hours

EC505.114.697

EC505.1384.672

图4. 通过从同一孔中重复取样检测细胞毒性。将生长于100

μ

l 无血清F12培养基中的20000个A549细胞用浓度不断

增加的洋地黄皂苷（digitonin）处理。在4小时和24小时这两个时间点，从上述相同孔中分别取出5

μ

l样品，按1:20

的比率稀释于LDH储存缓冲液中后冻存。融化样品，将其再稀释2倍，然后取50

μ

l稀释后的样品与50

μ

l LDH检测

试剂混匀。室温孵育60分钟后记录发光信号。A. 针对digitonin浓度绘制的相对发光单位（RLU）值。B. 使用上面的

公式计算细胞毒性百分比，并相对于digitonin浓度作图。RLU = Relative Luminescence Units（相对发光单位）。

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4.C. LDH阳性对照

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay中包含一个LDH阳性对照（从兔肌肉中纯化出的乳酸脱氢酶），可用来验证系统中其他

组分的性能，确定检测的线性范围，或用作比较多个微孔板或多次实验之间的数据的归一化因子。LDH滴定曲线的实

例如图5所示。

1. 使用275

μ

l的LDH储存缓冲液溶解乳酸脱氢酶，配制成1000 U/ ml的LDH标准品。轻轻混匀，直至溶解，然后

将溶液置于冰上。为避免多次冻融循环，将LDH标准品分装成小份儿并在–20℃以下存储。

2. 将10

μ

l的LDH标准品加入到3.115 ml的LDH储存缓冲液中，使1000 U/ ml的LDH标准品稀释至3.2 U/ ml。

3. 使用12通道的试剂槽，按下表所示将3.2 U/ ml的LDH标准品进一步稀释至32 mU/ ml，然后进行连续稀释。

稀释编号（＃）

1

2

3

4

5

6

7

8

LDH的体积 (

μ

l)

10

μ

l的3.2 U/ml标准品

（第4.C节，步骤2）

500

μ

l的＃1稀释液

500

μ

l的＃2稀释液

500

μ

l的＃3稀释液

500

μ

l的＃4稀释液

500

μ

l的＃5稀释液

500

μ

l的＃6稀释液

0

LDH储存缓冲液的体积 (

μ

l)

990

500

500

500

500

500

500

500

mU/ml

32

16

8

4

2

1

0.5

0

4. 从每个LDH标准品稀释液（＃1-8）中分别取三份50

μ

l的溶液，转移到96孔检测板的相应复孔中。板的剩余孔

可用作样品孔。

注意：如果需要，可仅用最高和最低稀释度溶液（# 1和# 8稀释液）作为阳性对照标准品。

5. 按照第3.B节的描述配制LDH检测试剂并将其转移到试剂槽中。

6. 使用多通道移液器，将50

μ

l配好的LDH检测试剂加入含有LDH标准品的96孔检测板的每个孔中。

7. 室温孵育60分钟。

10

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8. 记录发光信号。

注意：为了确定样品的相对发光单位(RLU)值是否在检测的线性范围内，首先绘制LDH阳性对照标准曲线的RLU

值，如图5所示。如果样品的RLU值落在LDH阳性对照标准曲线的线性范围内，那么样品值在本检测的线性范围内。

如果样品值超出了LDH阳性对照标准曲线的线性范围，则应调整样品稀释方案。由于RLU值取决于检测条件，因

此样品RLU值只能与在同一次检测中产生的LDH阳性对照标准曲线中的RLU值进行比较。

注意：为了验证实验样品的RLU值是否在检测的线性范围内，实验样品和LDH阳性对照标准曲线对应的样品应使

用相同的储存缓冲液进行制备，且在相同的微孔板中进行处理。

range of the assay.

8 × 10

1.2 × 10

7

6 × 10

U

L

R

4 × 10

2 × 10

)

U

L

R

1.01.52.02.5

(

8 × 10

6

0

0.00.5

LDH, m Unit/ml

e

c

n

e

c

s

e

n

i

m

4 × 10

6

u

L

0

35

LDH, mUnit/ml

图5. LDH阳性对照标准曲线的线性范围。将在LDH储存缓冲液中稀释的LDH阳性对照与LDH检测试剂等体积组合，

并在室温温育1小时。使用GloMax

®

仪器记录发光信号。这些值代表三个重复样品的平均值±标准差。RLU = 相对

发光单位。

5. 注意事项

5.A. 细胞培养基和血清

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay可以兼容不同的培养基配方。检测灵敏度高，可支持将培养基中的样品稀释5-300倍，

从而可最大限度减少培养基成分对检测反应的潜在影响。

组织培养基中添加的动物血清可能包含相当量的LDH，从而会增加背景发光，降低灵敏度。培养基中血清的存在不影

响使用小样本体积时LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay的检测能力，也不会对冷冻样品和稀释后样品随着时间变化的检测

产生影响。

使用血清含量更低或无血清的培养基，可以减少或消除背景发光。还可通过使用阴性对照来校正背景发光，以确定在

没有细胞存在的情况下来自培养基中的血清的发光。由该对照确定的发光值可用于归一化从其它样品获得的发光值。

请确保阴性对照的处理方式与实验样品的处理方式相同。例如，如果实验样品在检测前已经用LDH储存缓冲液稀释了

100倍，那么阴性对照样品也应使用相同的缓冲液稀释100倍。

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5.B. LDH在培养基中和在冷冻状态下的稳定性

为了评估从细胞中释放的LDH在冷冻后的稳定性，我们比较了裂解的细胞在冷冻前后的滴定曲线。如图6中的A图所

示，当裂解的细胞在LDH储存缓冲液中冷冻时，未观察到LDH活性的显著下降。但是，如果将细胞裂解物在添加了1%

BSA（牛血清蛋白）的PBS中稀释和冷冻时，LDH的活性则下降了85%（图6，B）。

为检验培养基中的死细胞释放出的LDH在37℃的稳定性，我们测定了细胞裂解后LDH在不同时间点的活性。我们的

数据表明LDH的活性并没有随着时间的推移而出现明显的损失（至少72个小时内；未显示数据）。

hours; data not shown).

A.

2 × 10

7

B.

unfrozen

frozen

4 × 10

7

unfrozen

frozen

L

u

m

i

n

e

s

c

e

n

c

e

(

R

L

U

)

1 × 10

7

L

u

m

i

n

e

s

c

e

n

c

e

(

R

L

U

)

1.5 × 10

7

3 × 10

7

2 × 10

7

5 × 10

6

1 × 10

7

0

0500600

0

Cells/Well

0500600

Cells/Well

图6. LDH在冷冻状态下的稳定性。将起始浓度为0.2 × 10

6

个细胞/ml的A549细胞裂解并在培养基中按1:20的比例

稀释至10000个细胞/ml。然后，使用LDH储存缓冲液（A图）或PBS+1% BSA （B图）将细胞再稀释两倍。将50

μ

l稀释后的样品与50

μ

l制备好的LDH检测试剂混匀，室温孵育60分钟后记录发光信号，测得LDH的活性。样品立

即检测（未冷冻unfrozen），或者在一次冻融循环后（冷冻frozen）检测。RLU = 相对发光单位。

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5.C. 使用终止液以获得稳定的发光信号

如需稳定的发光信号（例如，当需要同时处理多块板时），则可在添加了LDH检测试剂之后的任何时间里，通过添加

还原酶抑制剂（如menadione [甲萘醌]）使发光信号停止增加。添加甲萘醌可以阻止萤光素的持续生成，并允许在稍

后的时间读取平板。发光信号可在1-2个小时内保持稳定。可以将甲萘醌（例如，Sigma公司，目录号M5625）配制

成40mM的DMSO（二甲基亚砜）储备溶液，并将其加入到样品中至终浓度为0.25 mM。如需了解关于检测时间、最

佳检测灵敏度和线性度的信息，请参阅第3节。

5.D. 与活力检测或其它检测试剂盒联合使用

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay可与细胞活力检测试剂盒进行多重联用，包括Promega的RealTime-Glo™ MT、

CellTiter-Glo

®

和CellTiter-Fluor™检测试剂盒。在将培养基样品移除用于LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay检测后，可按

照RealTime-Glo™ MT、CellTiter-Fluor™或CellTiter-Glo

®

检测试剂盒提供的方案，将剩余的样品进行相应的活力检测。

多重检测可能有利于确认细胞健康的变化，或者鉴别出某次处理具有细胞抑制作用亦或是细胞毒性作用。

LDH-Glo™检测的非破坏性质使其能够与其它终点法检测试剂一起用于细胞健康（包括代谢）的正交测量。例如，剩

余的细胞和培养基可用于测定Caspase活性（Caspase-Glo

®

3/7检测试剂盒）或代谢物水平的变化（Glucose-Glo™

或Glutamate-Glo™检测试剂盒）。

(Caspase-Glo

3/7 Assay) or changes in metabolite levels (Glucose-Glo™ or Glutamate-Glo™ Assays).

®

2 × 10

CellTiter-Glo

3D Assay

6

LDH-Glo™ Assay

2.5 × 10

5

)

y

a

s

s

A

1.5 × 10

6

2 × 10

5

D

3

®

o

1 × 10

6

1.5 × 10

5

l

G

-

r

e

t

i

T

1 × 10

5

l

l

e

5 × 10

5

C

(

U

5 × 10

4

L

R

0

–4–3–2–101234

0

log [Aflatoxin B1], µM

LDH Assay CTG 3D Assay

EC503.520.4999

图7. LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay和CellTiter-Glo

®

3D Cell Viability Assay的联合使用。用黄曲霉毒素B1

（Aflatoxin B1）处理人体肝脏微组织48小时。将样品（10

μ

l）以1：2.5稀释度收集在PBS中，然后再进一步稀释10倍。

处理期间毒性的变化使用LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay测定，具体方法是将15

μ

l稀释后的样品与15

μ

l LDH检测试

剂混匀，室温孵育60分钟后记录发光信号。移取出样品进行LDH测定后，将等体积的CellTiter-Glo

®

3D试剂添加到

剩余的微组织样品中以评估细胞活力。RLU = 相对发光单位。

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6. 附录

6.A. 检测球状体（spheroid）培养物中时间依赖性的细胞毒性

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay非常适合使用少量细胞检测膜受损细胞中释放出的LDH。在此我们展示了使用该检测系

统测定在Corning

®

384孔超低吸附微孔板中形成的HCT-116球状体（spheroid）中药物诱导产生的细胞毒性的实例。

通过从相同孔中重复取样进行时间依赖性的毒性测定。在使用LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay进行检测之前，按第4.B

节所述冻存样品。

4.B until the LDH-Glo™ Assay was performed.

A.

1.2 × 10

6

B.

24 hours

48 hours

72 hours

1.5 × 10

6

24 hours

48 hours

72 hours

L

u

m

i

n

e

s

c

e

n

c

e

(

R

L

U

)

L

u

m

i

n

e

s

c

e

n

c

e

(

R

L

U

)

9 × 10

5

1 × 10

6

6 × 10

5

5 × 10

5

3 × 10

5

0

–4–3–2–10123

0

–2–1012

log [Panobinostat], µM

24 hours

EC5017.16

48 hours

3.544

72 hours

2.311

log [Doxorubicin], µM

24 hours

EC5017.09

48 hours

5.474

72 hours

3.844

图8. 来自相同样品孔的时间依赖性的细胞毒性。在Corning384孔超低吸附微孔板的每个孔中都接种2500个细胞，使

其形成HCT116球状体（spheroid），然后用帕比司他（Panobinostat）（A图）或阿霉素（Doxorubicin）（B图）处理。

在指定的时间点，从相同的孔中收集2.5

μ

l样品，并以1:10的稀释度将样品稀释并冻存在LDH储存缓冲液中。将样品

融化并进一步稀释2.5倍，然后使用LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay测定LDH水平。RLU = 相对发光单位。

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6.B.在ADCC实验中检测细胞特异性的细胞毒性

LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay可用于测定在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)研究中从膜受损的靶细胞

释放到细胞培养基中的LDH活性。图8中的ADCC实例证明LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay可用于检测利妥昔单抗

（rituximab）介导的靶细胞杀伤。EC

50

值与利妥昔单抗相关的文献(1)中报道的数值一致。

A.

B.

2 × 10

6

4 hours

RTX 3µg/ml 4 hours

6 hours

1,400,000

1,167,840

)

U

1.5 × 10

6

1,200,000

L

R

)

(

U

L

e

c

R

1,000,000

(

n

e

c

1 × 10

6

e

c

n

800,000

s

e

e

c

n

s

i

m

e

n

600,000

u

i

407,150

L

5 × 10

5

m

u

L

400,000

307,258

200,000

11,782

98,917

0

–4–3–2–101

0

log [RTX], µg/ml

Medium

Target Cell

Effector Cell

Effector + Target

ADCC

4 hours6 hours

EC500.089580.09978

图9. ADCC示例。按照效应细胞（外周血单核细胞[PBMC]）:靶细胞(Daudi)=20:1的比率，将细胞铺板，并用不同

浓度的利妥昔单抗（RTX），三复孔，处理细胞4或6小时。从相同孔中移出培养基样品(2.5

μ

l)，用LDH储存缓冲液

(47.5

μ

l)稀释并冷冻。取25

μ

l 融化后的样品加入等体积的LDH检测试剂中，室温孵育60分钟后记录发光信号。A. 将

利妥昔单抗浓度相对于RLU作图，使用四参数（4PL）拟合曲线计算EC

50

。B. 来自对照孔的RLU值（在与利妥昔单

抗处理组相同的板上进行）显示靶细胞或效应细胞单独存在时发光信号很低，并且加入利妥昔单抗是细胞杀伤所必需的。

ADCC = 效应细胞 + 靶细胞 + 利妥昔单抗（RTX）。RLU = 相对发光单位。

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6.C. 评估细胞数量和细胞增殖

乳酸脱氢酶是一种胞浆蛋白，大量存在于多种细胞的细胞质中。LDH活性与孔中细胞的数量直接相关，可以用于定量

细胞在增殖期间的数量变化，或用作测定孔中细胞总数的归一化因子。孔中存在的细胞数量与发光值成正比，而后者

代表的是LDH活性。此外，通过测量释放到培养基中的LDH的含量，并且与LDH总量的变化进行比较，可以鉴定和

表征影响细胞增殖的药物。具体实例如图10所示。用二甲双胍处理细胞后，未检测到释放到培养基中的LDH量有明

显增加（蓝柱）。对照组样品中的总LDH量随着时间的增加而增加，但二甲双胍处理组样品中的总LDH量不随时间

延长而变化。这些数据表明二甲双胍会抑制细胞增殖，但不会使细胞裂解。

7,000,000

6,000,000

L

u

m

i

n

e

s

c

e

n

c

e

(

R

L

U

)

5,000,000

4,000,000

3,000,000

2,000,000

1,000,000

0

–+–+

24 hours

–+–+

48 hours

–+–+

72 hours

图10. 检测细胞增殖。96孔板每孔接种2,500个A549细胞，在不加（-）或加入（+）10mM 二甲双胍（metformin）

的条件下培养24、48或72小时。在每个时间点移出5

μ

l培养基上清样品，稀释到95

μ

l LDH储存缓冲液中并冻存，用

于检测从细胞内释放到培养基中的LDH（蓝色柱形）。细胞样品加入Triton X-100孵育10分钟，用同样的方式收集样

品并冻存，用于检测细胞中总的LDH释放（红色柱形）。将所有样品融化，用LDH储存缓冲液进一步稀释5倍，加

入等体积（50

μ

l）的LDH检测试剂，室温孵育60分钟后记录发光信号。RLU=相对发光单位。

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6.D.参考文献

1. Tada, M. et al. (2014) Development of a Cell-Based Assay Measuring the Activation of FcRIIa for the Characterization

of Therapeutic Monoclonal Antibodies. PLoS ONE 94(4), e95787. Doi:10.1371/.0095787

6.E. 相关产品

细胞活力检测产品

产品规格目录号

100次反应G9711

RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay10 × 100次反应G9712

1,000次反应G9713

10 mlG9681

CellTiter-Glo

®

3D Assay10 × 10 mlG9682

100 mlG9683

10 mlG9241

CellTiter-Glo

®

2.0 Assay100 mlG9242

500 mlG9243

10 mlG8741

CellTox™ Green Cytotoxicity Assay50 mlG8742

100 mlG8743

细胞凋亡检测产品

产品规格目录号

RealTime-Glo™ Apoptosis and Necrosis Assay

100次反应JA1011

1,000次反应JA1012

2.5 mlG8090

Caspase-Glo

®

3/7 Assay

10 mlG8091

10 × 10 mlG8093

100 mlG8092

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能量代谢检测产品

产品

Glucose Uptake-Glo™ Assay

Glucose-Glo™ Assay

Glutamate-Glo™ Assay

Glutamine/Glutamate-Glo™ Assay

Lactate-Glo™ Assay

NAD(P)H-Glo™ Detection System

NAD/NADH-Glo™ Assay

NADP/NADPH-Glo™ Assay

Mitochondrial ToxGlo™ Assay

可提供其它规格。

规格

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

目录号

J1341

J6021

J7021

J8021

J5021

G9061

G9071

G9081

G8000

发光检测仪和多功能读板仪

产品

GloMax

®

Navigator Microplate Luminometer

GloMax

®

Discover System

GloMax

®

Explorer System

目录号

GM2000

GM3000

GM3500

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Caspase-Glo, CellTiter-Glo, and GloMax are registered trademarks of Promega Corporation. CellTiter-Fluor, CellTox, Glucose Uptake-Glo, Glucose-Glo ,

Glutamate-Glo, Lactate-Glo, LDH-Glo and RealTime-Glo are trademarks of Promega Corporation.

Corning and Costar are registered trademarks of Corning, Inc.

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