三带喙库蚊微卫星标记的筛选及遗传多样性分析

第

27

卷第

4

期2020年12月寄生虫与医学昆虫学报Acta

Parasitol.

Med.

Entomol.

.

27,

No.

4Dec.

，

2020doi：10.

3969/.1005-0507.

2020. 04.

004三带喙库蚊微卫星标记的筛选及遗传多样性分析褚宏亮1吴治明1田野1高剑2周明浩g

赵彤言2*

*(1.江苏省疾病预防控制中心，江苏南京210009

；

2.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，

病原微生物生物安全国家重点实验室，北京市虫媒病与自然疫源性疾病重点实验室，北京100071)摘要为了便于对我国三带喙库蚊种群的遗传结构和多样性进行动态检测，本研究利用磁珠富集法进行三

带喙库蚊微卫星标记的开发和筛选，共获得40个微卫星位点，且位点的多态性验证结果表明：有24个位

点在不同三带喙库蚊地理株间呈现多态性。微卫星位点的遗传多样性分析结果表明：各位点的平均多态信

息含量(PIC)和香农指数(SI)均较高，其中位点P17最高(PIC

=

0.853,

SI

=

2.

281),最低的为位点

P40

(PIC =

0.

503,

SI=1.

195),都属于高度多态性位点，适用于后续三带喙库蚊种群遗传多样性及遗传结

构的研究。关键词三带喙库蚊；日本脑炎病毒；磁珠富集法；微卫星标记；遗传多样性三带喙库蚊Culex

tritaeniorhynchus是亚洲的

常见蚊种，能够传播多种虫媒病毒，如裂谷热病

毒、西尼罗病毒和登革热病毒等，更是日本脑炎

法进行三带喙库蚊微卫星标记的开发，

同时对所

得的遗传标记进行遗传多样性评估。病毒(Japanese

encephalitis

,

JE)的主要传播媒

1

材料与方法1.1蚊虫采集2015年7—8月,在江苏省16个不同地区

介(Self

et

al.

,

1973)O三带喙库蚊偏向孳生于

富含植物的水体中，其中稻田是其主要孳生地

(李春晓等，2007)。中国作为一个粮食大国，

在过去的几十年中，水稻的种植范围在全国范围

猪圈、牛棚或稻田等适宜区域，采用诱蚊灯法或

二氧化碳诱蚊灯法进行三带喙库蚊采集，采集时

内大幅度地增长，成为了世界第二大粮食种植基

地(Ghose,

2014)。由此，引起的三带喙库蚊种

群密度的增长也引起了人们对相关虫媒传染病流

间为6：

00

pm~8：

00

pm。采集完成后用乙醚麻

醉并分类鉴定。最后将挑选的三带喙库蚊按地区

行的担忧。微卫星标记(simple

sequence

repeats，

SSRs)是一类广泛存在于原核和真核生物基因

编号后放入-70T冷冻保存，用于后续的基因组

提取。1.2实验试剂和仪器组非编码区中的短重复序列，该序列一般由6个

实验试剂：Qiagen

blood

and

tissue

kit

(69504)、Taq

酶(Takara)、EcoR

I、Mse

I、

以内碱基组成，且由于序列在不同个体中重复次

数的差异而表现出高度的多态性(Vieira

et

al.,2016)。目前，对于埃及伊纹Aedes

aegypti、白纹

MagneSphere

Magnetic

Separation

Products

kit

(Promega)、用生物素标记的探针(AG

)

l5和

(GT),无水乙醇以及琼脂糖等。伊蚊Aedes

albopictus和尖音库蚊复合组Culex

pipiens

Complex微卫星标记的研究等均有大量报

实验仪器：超净工作台(SW-CJ-1D)、全自

动制冰机(SANYO

SIM-F14)、立式自动电热压

力蒸汽灭菌锅(LDZX-40B)、高速台式冷冻离

道，而在三带喙库蚊研究方面仍为空白(Julie

et

al.

，

2005；

Lovin

et

al.

，

2009；

Renke

et

al.

，

2020)。为便于今后开展三带喙库蚊种群的遗传

心机(TGL-16G)、电泳仪(DYY-6B)、凝胶

成像分析仪(GELl-D0C2000)、Bio-Rad

PCR

扩结构和多样性的动态检测，本研究应用磁珠富集

收稿日期：

2020-09-08*基金项目：江苏省青年医学人才(QNRC2016544)；江苏省卫生健康委面上课题(H2018103)**

通信作者：E-mail：周明浩

zmh@

；赵彤言

tongyangzhao@

・218・

褚宏亮等：三带喙库蚊微卫星标记的筛选及遗传多样性分析增仪、3730XL

测序仪(Applied

Biosystems,

USA)

等。pL)

,

6

pL

Solution

I,于16C连接过夜。而后

将12

pL连接产物加入150

pL感受态细胞于

42C水浴中热激90s,迅速移入冰中，静置5

1.3三带喙库蚊基因组提取及质量检测随机选取5个地理株用作微卫星引物开发及

多态性验证。蚊虫基因组提取按照DNA提取试

min,加入900

pL

LB培养液，放入37C恒温箱

摇床，150

r/min培养1

h。分别取100、200、

300以及400

pL恢复培养液涂于含氨卞青霉素

剂盒的说明书进行(Shi

et

al.,

2017),而后用1.

5%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop核酸检测仪

的LB培养皿上，倒置于37C培养过夜。用

pMD18-T

载体的通用引物

M13-47

(CGCCAGGG

TTTTCCCAGTCA-CGAC)或

RV-M

(GAGCGGAT

分别对三带喙库蚊基因组DNA的完整性、浓度

以及纯度进行检测。1.4三带喙库蚊SSR引物开发和验证1.4.1基因组酶切和接头连接在37C下利用限

制性内切酶EcoR

I和Mse

I对三带喙库蚊基因

组DNA进行双酶切处理，处理时间为3

h,酶切

体系为50

pL,其中包含基因组DNA

1

pg、10x

T4

DNA

ligase

Buffer

5

pL、EcoR

I

(

10

U/pL)

1

pL以及Mse

I

(10

U/pL)

1

pL,剩余部分用

水补齐。基因组酶切产物与EcoR

I接头和Mse

I

接头于4C连接过夜，连接体系为20

pL,其中

包括酶切产物7

pL,

EcoR

I接头75

pmol、Mse

I

接头

75

pmol、T4

DNA

ligase

1.5

U、10xT4

DNA

ligase

Buffer

2

pL

以及

ddH2O

10.

5

pL。1.4.2

连接产物的预扩增PCR扩增体系为20

pL，

含连接接头的酶切

DNA

2

pL、

2xPCRmix

10

pL、E00

10

pmol、M00

10

pmol、Taq

酶

0.2

U,

其他用水补齐。PCR反应程序为：94C预变性5

min；

94C变性

45

s、50C退火

45

s、72C延伸

45

s、30次循环；72C延伸10

min；

4C保存。1.4.3

(AG),5和(GT)"探针杂交和磁珠捕捉

用生物素标记的探针(AG)15和(GT)15进行杂

交：将200

pmol探针与100

pL

PCR产物在沸水

中变性5

min后，立即置于冰上10

min,加入2.5

pL

20xSSC混合液，在62C水浴锅中杂交

30

min,取出于室温冷却。将杂交混合液和平衡

好的磁珠混匀，在室温放置10

min,每2~3

min

轻轻摇动一下，使生物素充分吸附在包被亲和素

的磁珠上，而后用0.

1

xSSC清洗磁珠4次，最

后加入100

pL灭菌ddH2O进行洗脱。1.4.4富集产物的扩增、克隆以及阳性克隆的

筛选富集产物扩增反应程序为：94C变性45

s,

50C退火45

s,

72C延伸45

s，循环5次；72C

延伸10

min；

4C保存。扩增产物纯化并冷冻干

燥浓缩至约6

pL,产物与pMD18-T

(TaKaRa,

D103

A)载体连接，连接体系为12

pL,其中含5.5

pL

PCR

产物，1

pL

pMD18-T

载体(50

ng/

AACAATTTCACACAGG)分别与重复序列

(AG"组成的双引物对AG富集文库菌落进行筛

选检测。反应程序为：94C预变性10

min；

94C

变性45

s,

58C退火45

s,

72C延伸45

s,循环

33

次；72C延伸

10

min,

4C保存；取5

pL

PCR

产物用于2%琼脂糖凝胶电泳检测，对扩增出清

晰电泳条带的菌落进行质粒测序。1.4.5序列分析和SSR引物筛选利用Chromas

软件对序列峰图进行手工校正，并筛选出含有

SSR位点的序列。而后利用DNAman软件去除载

体和接头序列，

CodonCode

Aligner

软件进行序列

比对分析，去除重复序列后，用Primers

5.

0软

件进行SSR引物设计。采用丙烯酰胺凝胶电泳

(PAGE)对初筛合格引物进行复筛，检测样本

数量为5,筛选具有扩增多态性的引物为复筛合

格引物。2结果2.1三带喙库蚊基因组检测三带喙库蚊基因组DNA的电泳结果显示:

基因组DNA条带单一且明亮，同时，基因组

DNA的吸光度值检测结果显示：所有检测样本

DNA的OD260/280值均位于1-6-2.0之间，且

DNA浓度值为60~100ng/pL,这表明本研究提

取的三带喙库蚊基因组较完整且浓度较高；

基因

组DNA双酶切产物的电泳图呈现弥散状，这表

明获得的SSR短基因组DNA质量适合后续的实

验(图1)。2.2微卫星位点检测和多态性验证本实验共挑选了

100个阳性克隆进行测序

(图2-a),测序结果经SSR

Hunter软件分析共获

得了

40个含有微卫星位点的序列,这些微卫星

位点的PAGE多态性验证结果表明：有24个位

点在不同三带喙库蚊地理株间呈现高度的多态

-219

-

寄生虫与医学昆虫学报第27卷第4期性，这些位点引物的GenBank登记号为：

MW340914

〜MW340937

（图

2-b~f,表

1）。0.823之间，平均观察杂合度为0.653,而期望

杂合度（He）在0.530〜0.857之间，平均期望

2.

3微卫星位点遗传多样性分析本研究从24个微卫星多态性位点中选取10

杂合度为0.752。各位点的平均多态信息含量

（PIC）和香农指数（SI）结果基本一致，其中

P17

最高（PIC

=

0.853,

SI

=

2.

281）,最低的为

个进行了遗传多样性评估，结果表明：这些位点

的等位基因数（Na）在9〜27之间，平均等位

基因数为18；观察杂合度（Ho）在0.437〜

P40

（PIC

=

0.

503,

SI=

1.

195）,都属于高度多

态性位点

（

表

2）

。图1三带喙库蚊基因组和基因组酶切产物电泳图Fig.

1

Genomic

DNA

and

restriction

enzyme

digested

genomic

DNA

electrophoresis

maps

of

Cx.

tritaeniorhynchus

1-5：三带喙库蚊5个地理株的基因组DNA；

6-7；三带喙库蚊基因组酶切产物；M：

DL

2000.1-5

:

Genomic

DNA

of

five

different

Cx.

tritaeniorhynchus

samples；

6-7

:

Restriction

enzyme

digested

genomic

DNA；

M:

DL

2000.表1三带喙库蚊微24个卫星位点及序列信息Tab・

1

Details

on

24

pairs

of

microsatellite

loci

and

their

sequences

in

Cx.

tritaeniorhynchus引物名称PrimerP1正向序列Forward

(5f)反向序列Reverse

(5V)重复基元Motif片段大小Fragment

size

(

bp)GenBank登记号GenBank

340914ATCACTGTTGTAAAGTATGCATGACGACTAAAATGTTTGAGTGTGGTCCCACCATACTCACCG(

CT)

9(TC)1211013099P2P4P5AATGAGCAACGATTGTTCCCGAAGCACCCCAACGAATGACACGATGAAAGCACAGACGAAGGGMW340915MW340916AATTCCAAGCCTGAAACCTAATTGAGGGGTGTTGTTGGAGAG(

CT)

9(CT)

17(TC)10(TC)13184127MW340917MW340918MW340919P6P7P8ATTGCTAACCGAGTGACACAACCTTCATCTCTCCCATTCCAACGACGACAACAAACGAAAGAGCGACGACCACCTGAGTTTACA163TCTTCTCTTGGTGTTGGTGTCACTTCCTTCATTCCCGGCGTCATCGATTGAATTTTTGTTTGA(CT)

13(CT)

17(TC)1MW340920P9AACGTGTGGCTTGGCCAGTCTMW340921MW340922P11P13AGAAACAATCGCAAGCCAACACACCTTCTTTCTTTCTCTCTGGGCACCCGCCAAAAGGACAAATGAATGTGTTGATTTTTGTCT(CT)

12(CT)

MW340923MW340924P16P17CCGGAACGAGTTGGTTTTATTGTTATTTTGATCGCCGAAGGGAGGCAGAACATTCAATCAGGTCAAGTACGTGTGTGTGTTGGTGGTAATCACAACACATCCGAGAGGTGGGTATGAGAGGTGAGGTTTC(GA)

14(

CT)

6MW340925MW340926P19P22122135TGGTTTTGTTGGCAGTTGTCTACCGCAATCTCTCTGTCTAACACAAAGAGACGTCCTGTGTGCACCTACTAAATACTGGCACTGGCTGTCAGCCGTGAATCATTCTTCACCAACACAAACACTCACT(GT)

6(

GTC)

6MW340927MW340928MW340929P23P24129113195AAATGAGCGACACCTGGCGAAG(GT)

6(GT)

7(GT)6CTGTP25TAAAAATACAAAACTCGCACAMW340930P31P32TGACAATGGTGGTAGAGAGCAGAGCATAATAAACAAGTGTCTGTGCCAGACACGTGTGCCACCACTGGAGATGGCAAACTGCAGGCTCTCTCTCAAATCTGAACACATTCCACTGACAAGAGAGCCCC106MW340931MW340932(GT)

6(GT)

8(

GT)

100137P33P34MW340933MW340934GAATTCCACCGTGATGTCGTGAAACCCCCTGAAACACATTGAP35P38AACTGAGTGTGGTGTAGGTTGAGCATTTAGCCGTCTTCCTTTTATTAGCCGCTCTTGTCCGAAAAATTCCGGAAGTGTGTTTATGCTTTATGTCTCGGGATTTTGTT(TG)7MW340935MW340936(GT)

7(TG)8P40ATCCACCCGCTCCACTACTCT180MW340937-220

-

褚宏亮等：三带喙库蚊微卫星标记的筛选及遗传多样性分析bp5⑻•

300200J180-

・

160,140孔.120ci

100P17

P19

P22

P23

P24

P25bp340P29

P30

P31

P32

P33P34bp500400300；200

|•

180

1・160・；140

=112图2三带喙库蚊微卫星位点多态性验证Fig.

2

Verification

of

microsatellite

locus

polymorphism

in

Cx.

tritaeniorhynchusa：阳性克隆电泳筛选；b~f：各微卫星位点的PAGE胶电泳图；P1~P40为微卫星位点编号；M：

DNA

marker.

a：

Electrophoresis

screening

of

positive

clones；

b-f：

Polyacrylamide

gel

electrophoresis

of

each microsatellite

locus；

P1-P40：

Microsatellite

locus

number；

M：

DNA

marker.表2三带喙库蚊10个微卫星位点遗传多样性分析Tab・ 2

Genetic

diversity

analysis

of

ten

microsatellite法有很多，如磁珠富集法和咼通量测序法。而相

比于高通量测序法，传统的磁珠富集法在兼具准

确度高的同时，费用相对低廉且操作简单

（Senan

et

al.

,

2014）,因此本研究选用该法进行

loci

in

Cx.

tritaeniorhynchus引物

名称PrimerP1等位基因数Na香浓

指数SI1.973观测杂

合度Ho0.7820.7820.

757期望杂

合度He0.

8330.

8100.

7780.

7500.

7520.

7600.

8570.

756多态信

息位点PIC微卫星位点的开发。16270.

8110.

7870.

7440.

7380.

7370.

7360.

8530.718多态信息位点值（PIC）最早由Botstein等

（1980）提出，用以评估微卫星位点多态性的高

P22.

0061.7311.9851.723P6P71524低，以确定其是否适用于种群遗传连锁分析。而

根据Ditta等（2018）对于PIC值的判定，本研

究测试的10个微卫星位点均呈现高度多态性,

0.6370.

597P9151924P11P171.7810.7120.

8232. 2811.5311.538即PIC>0.

50；同时，基于微卫星位点的三带喙

库蚊杂合度分析结果也表明：这10个微卫星位

P19P32P409160.5330.

4650.

4370.6980.

5300.

7520.67113181. 1951.7740.

5030.

730点能够准确地分辨种群观测杂合度（Ho）和期

望杂合度（He）的差异，从而评估三带喙库蚊

Mean0.653种群结构受外来选择和近交等因素影响的大小

3讨论在传统研究中，研究人员常通过文献和相关

数据库检索以及近缘物种交叉扩增的方法获取微

卫星引物，然而，对于三带喙库蚊微卫星位点研

（孙洁茹等，2011）。因此，本研究开发的三带喙

库蚊微卫星位点能够适用于后续三带喙库蚊种群

遗传多样性及遗传结构研究。参考文献Botstein D，

White

RL，

Skolnick

M

et

al.

Construction

of

a

genetic

究仍为空白。因此，为了获得高效的微卫星位

点，

本研究从基因组出发，

进行三带喙库蚊微卫

linkage

map

in

man

using

restriction

fragment

length

polymorphisms

[

J]. Am

J Hum Genet.

,

1980,

32:

A, Zhou

Z,

Cai

X

et

al.

Genome-wide

mining

and

星位点的重新开发。目前，微卫星位点开发的方

-221 -

寄生虫与医学昆虫学报characterization

of

SSR

markers

for

gene

mapping

and

gene

diversity

in

Gossypium

barbadense

L.

and

Gossypium

darwinii

G.

第

27

卷第

4

期81：

1

567-1

LS,

Shin

HK,

Kim

KH

et

al.

Ecological

studies

on

Culex

wTatt

accessions

[J].

Agronomy,

2018,

8

(9)：

niorhynchus

as

a

vector

of

Japanese

encephalitis

[

J

]

.

Bull

World

Health Organ.

,

1973,

49

(1)：

41

-

B.

Food

security

and

food

self-sufficiency

in

China： from

past

to

2050

[J].

Food

Energy

Secur.

,

2014,

3

(2)：

LS,

Nusha

K,

Micheal

AM

et

al.

Cross-species

comparison

of

Senan

S,

Kizhakayil

D,

Sasikumar B

et

al.

Methods

for

development

of

microsatellite

markers：

An

overview.

Notulae

ScientiaBiologicae,

2014,

6

(1)：

atellite

loci

in

the

Culex

pipiens

complex

and

beyond

[

J]

.

Mol Ecol

Notes.

,

2005,

5

(3)

:

QM,

Zhang

HD,

Wang

G

et

al

The

genetic

diversity

and

Li

CX,

Guo

XX,

Huang

EJ

et

al.

Discovery

of

new

breeding

sites

ofCulex

tritaeniorhynchus

in

the

city

[

J].

Chin

J

Vector

Biol

population

structure

of

domestic

Aedes

aegypti

(

Diptera：

Culicidae)

in

Y

unnan

Province,

southwestern

China

[ J

].

Parasites

Vectors,

2017,

10:

l.,

2007,

18

(

1

)：

31.[李春晓，郭晓霞，黄恩炯，

等.城市中三带喙库蚊新孳生地的发现[J].中国媒介生物

学及控制杂志，2007,

18

(

1)

:

31.]Lovin

DD,

Washington

KO,

Debruyn

B

et

al.

Genome-based

Sun

JY

,

Li

Y

,

Yan

S

et

al.

Microsatellite

marker

analysis

of

genetic-

diversity

of

Cacopsylla

chinensis

[

J].

Acta

Entomol

Sinica.,

2011,54

(7)：

820-827.[孙洁茹，李燕，闰硕，等.微卫星

polymorphic

microsatellite

development

and

validation

in

the

mosquito

Aedes

aegypti

and

application

to

population

genetics

in

标记分析中国梨木虱种群的遗传多样性[J].昆虫学报,

2011,

54

(7)

:

820-827.]Haiti

[J].

BMC

Genomics,

2009,

10：

ML,

Santini

L,

Diniz

AL

et

al.

Microsatellite

markers:

what

Renke

L,

Anna

H,

Stephanie

J

et

al. Microsatellite

typing

of

Aedes

they

mean

and

why

they

are

so

useful

[

J].

Genet

Mol

Biol.,

2016,

39

(3)

:

ctus

(

Diptera：

Culicidae

)

populations

from

Germany

suggests

regular

introductions

[ J].

Infect

Genet

Evol.

,

2020,ISOLATION

AND

GENETIC

DIVERSITY

ANALYSIS

OF

MICROSATELLITE

MARKERS

IN

CULEX

TRITAENIORHYNCHUS

(DIPTERA：

CULICIDAE)CHU

Hong-Liang1

WU

Zhi-Ming1

TIAN

Ye1

GAO

Jian2

ZHOU

Ming-Hao1*

ZHAO

Tong-Yan2*(1.

Center

for

Disease

Control

and

Prevention,

of

Jiangsu

Province,

Nanjing

210009,

China

；2.

Beijing

Key

Laboratory

of

Vector

Borne

and

Natural Infectious

Disease,

State

Key

Laboratory

of

Pathogen

and

Biosecurity,

Institute

of Microbiology

and

Epidemiology,

AMMS,

Beijing

100071,

China)Abstract

To

monitor

the

dynamic

changes

of

genetic

diversity

and

population

structure

of

Culex

tritaeniorhynchus

populations

in

China,

a

total

of

40

microsatellite

loci

were

developed

from

its

genome

via

Magnetic

Beads

Enrichment

method.

The

polymorphism

verification

result

showed

that

24

loci

of

all

displayed

polymorphic

among

Cx.

tritaeniorhynchus

populations

from

different

geographic

regions.

Meanwhile,

genetic diversity

analysis

results

of

these

microsatellite

loci

showed

that

both

of

the

average

polymorphic

information

content

(PIC)

and

Shannon

index

(SI)

of

these

loci

were

high,

with

the

highest

one

was

locus

P17

(

PIC

=

0.

853

,

SI

=

2.

281

)

and

lowest

one

was

locus

P40

(

PIC

=

0.

503

,

SI

=

1.

195

).

Therefore,

these

new

developed

microsatellite

loci

are

suitable

for

the

subsequent

study

of

the

genetic

diversity

and

population

structure

of

Cx.

words

Culex

tritaeniorhynchus

；」apanese

encephalitis

virus

；

Magnetic

beads

enrichment

method

；

Microsatellite

marker

；

Genetic

diversityCorresponding

authors

・222・