重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究_朱英杰

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· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2010, 45 (3): 376−382

重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究

朱英杰1, 2, 陈士林2, 姚 辉2*, 谭 睿1*, 宋经元2, 罗 焜3, 鲁 静4

(1. 西南交通大学生命科学与工程学院, 四川 成都 610031; 2. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所,

北京 100193; 3. 湖北中医学院药学院, 湖北 武汉 430061; 4. 中国药品生物制品检定所, 北京 100050)

摘要: 为评价DNA条形码候选序列对重楼属药用植物的鉴定作用, 探讨重楼属药用植物鉴定新方法, 本研究对重楼属11个物种17份样品的psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK和核ITS2序列进行PCR扩增和测序,

比较各序列扩增和测序效率、种内和种间变异, 进行barcoding gap分析, 采用BLAST1和Nearest Distance方法评价不同序列的鉴定能力。结果显示, ITS2序列在所研究的重楼属药用植物中的扩增和测序效率均为100%, 其种内种间变异、barcoding gap与其他DNA条形码候选序列相比具有明显的优势, ITS2序列在重楼属中的鉴定成功率达到100%, 而生物条形码协会 (CBOL) 植物工作组推荐的matK和rbcL序列的鉴定成功率分别为52.9%

和5.9%, 二者联合鉴定能力没有提高, 对于ITS2序列扩大至29个物种67份样品依然具有100%的鉴定成功率。实验结果表明, ITS2序列能够准确鉴定重楼属药用植物, 可以作为潜在的药用植物通用条形码序列。

关键词: 重楼属; DNA 条形码; ITS2; 药用植物; 鉴定

中图分类号: R931.5 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2010) 03-0376-07

DNA barcoding the medicinal plants of the genus Paris

ZHU Ying-jie1, 2, CHEN Shi-lin2, YAO Hui2*, TAN Rui1*, SONG Jing-yuan2, LUO Kun3, LU Jing4

(1. School of Bioscience and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China; 2. Institute of Medicinal

Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;

3. School of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, China;

4. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China)

Abstract: DNA barcoding is a technique in which species identification and discovery are performed by

using short and standard fragments of DNA sequences. In this study, eleven species of Paris, including seven

varieties, were sampled. Five chloroplast sequences, psbA-trnH, rpoB, rpoC1, rbcL, matK, and one nuclear

marker, the second internal transcribed spacer (ITS2) of ribosomal DNA, were amplified and sequenced. The

PCR amplification and sequencing efficiency, intra- and inter-specific divergence and barcoding gap were used

to evaluate different loci, and the identification efficiency was assessed using BLAST1 and Nearest Distance

methods. The ITS2 sequences in the studied samples of Paris were amplified and sequenced successfully using

primers designed by our group, while matK showed low level in the amplification and psbA-trnH was difficult for

sequencing because of over 800 bp and poly (A) structure. Analysis of the intra- and inter-specific divergence

and barcoding gap showed ITS2 was superior to other loci. The ITS2 showed a much higher percentage of

success (100%) in identification than other five loci, none of which indicated more than 50% except matK

(52.9%). The 2-locus combination of rbcL+matK didn’t improve ability of authentication. In addition, the

rate of successful identification with ITS2 kept 100% when the samples were expanded to 67 samples of 29

species. In conclusion, ITS2 can be used to correctly identify medicinal plants of Paris, and it will be a potential

DNA barcode for identifying medicinal plants of other taxa.

收稿日期: 2009-11-17.

基金项目: 国际科技合作项目 (2007DFA30990); 卫生行业科研专项 (200802043).

*通讯作者 Tel: 86-10-62899727, Fax: 86-10-62899776, E-mail: scauyaoh@, @

朱英杰等: 重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究

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Key words: Paris; DNA barcoding; ITS2; medicinal plant; identification

重楼属 (Paris L.) 是百合科多年生草本植物,

《中国植物志》英文版[1]中记载重楼属植物全世界约有39个物种 (含19个变种), 主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用, 其中滇重楼 [Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)

Hand.- Mazz.] 及华重楼 [P. polyphylla var. chinensis

(Franch.) Hara.] 收载于2005年版《中国药典》, 是云南白药等多种中药的重要原料之一。然而重楼植物分类复杂, 由于不同类群的特征性状交叉重叠, 各类型界限模糊不清, 给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来, 随着对重楼需求量的增大, 野生重楼资源急剧减少, 商品药材品种混乱, 药材品质不一, 寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼植物鉴定, 已有形态学、细胞学 (包括核型和染色体多态性)

和RAPD、AFLP等DNA分子标记方面[4, 5]的研究, 这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而DNA条形码技术直接利用DNA序列进行物种的鉴定, 具有独一无二的可重复性, 为药用植物鉴定带来了新的机遇[6]。

自加拿大动物学家Paul Hebert[7]于2003年首次提出DNA条形码 (DNA barcoding) 概念以来, DNA条形码研究已成为近年来生物分类学研究的热点和前沿[8]。DNA条形码技术是利用基因组中一段通用的标准短序列来进行物种鉴定的分子诊断新技术[6],

通过建立生物DNA条形码系统能够实现快速、准确和自动化的物种鉴定。截止目前, 研究者们已经提出了10多条植物候选DNA条形码序列[9], 并在不同的类群中对各条形码的鉴定能力进行了考察, CBOL植物工作组提出使用rbcL+matK复合序列作为植物界的通用条形码序列[10][3][2]药用植物鉴定中的能力, 以期建立重楼属药用植物数字鉴定方法。

材料与方法

材料 重楼属实验材料11个物种 (含7个变种)

17份样品采自云南、四川等地, 经中国药品生物制品检定所鲁静研究员和中国医学科学院药用植物研究所林余霖副研究员鉴定, 凭证标本保存于中国药品生物制品检定所和中国医学科学院药用植物研究所。实验材料详见表1, GenBank登录号为GU178884-

GU178972。

Table 1 Samples for testing potential barcodes

Samples name

Paris vietnamensis

P. verticillata

P. polyphylla var. yunnanensisP. polyphylla var. yunnanensisP. polyphylla var. yunnanensisSampling location

Voucher numberYunnan Simao

Liaoning Dalian

Yunnan Wuding

Yunnan Wuding

Yunnan Wuding

PS1642MT01PS1635MT01PS1637MT05PS1637MT04PS1637MT01P. polyphylla var. chinensis Yunnan Wuding PS0051MT03P. polyphylla var. chinensis Shanxi Qinling PS0051MT02P. polyphylla var. chinensis Sichuan Hongya PS0051MT26P. polyphylla var. stenophylla Sichuan Hongya PS1644MT21P. polyphylla var. stenophylla Yunnan Wuding PS1644MT01P. fargesii var. fargesii

P. polyphylla var.

pseudothibetica

P. polyphylla var.

pseudothibetica

P. luquanensis

P. marmorata

P. delavayi var. delavayi

Yunnan Wuding

Yunnan Wuding

Yunnan Wuding

Yunnan Wuding

Yunnan Wuding

Yunnan Wuding

PS1643MT01PS1636MT01

PS1636MT02

PS1641MT01PS1638MT01PS1640MT01P. polyphylla var. polyphylla Sichuan Hongya PS1651MT01, 但由于扩增效率、鉴定成功率

等问题, 其在植物界的通用性仍受到质疑。ITS2是

真核生物rDNA上的一段顺反子, 位于5.8S和26S

rRNA之间, 它在物种间具有显著地差异, 因此, 被广泛用于物种分类及系统进化研究[11]。ITS2序列具有适合扩增和测序的长度, 有利于对发生降解的样ITS2片段在物种水平的变异较快, 有品进行扩增[12]。更多的突变位点以区分不同的物种, 因此, 在DNA条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。

本研究应用近年来提出的植物DNA条形码候选序列psbA-trnH、rpoB、rpoC1、rbcL、matK[13−15], 以及在系统进化中应用广泛的核ITS2序列[16]对重楼属进行研究, 考查不同DNA条形码候选序列在重楼属样品DNA的提取、PCR扩增和测序 药材根茎使用70%乙醇擦洗表面后研磨, 无水乙醇浸泡5 min后脱水, 植物叶片采用硅胶进行干燥, 取样10 mg,

用DNA提取研磨仪 (Retsch MM400, Germany) 研磨1 min (1 800 r·min−1) 后, 使用北京天根生化DNA提取试剂盒提取总DNA。扩增ITS2序列所用引物, 正向为5'-GCGATACTTGGTGTGAAT-3', 反向为5'-GA

CGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。PCR反应体积为25

µL, 体系内含MgCl2 2 µL (25 mmol·L−1)、dNTP 2 µL

(2.5 mmol·L−1)、PCR buffer 2.5 µL (10×)、引物各1.0

Taq聚合酶1.0 U、总DNA约1 µL

µL (2.5 µmol·L−1)、(~30 ng)。扩增程序: 94 ℃, 变性5 min; 再进行40

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个循环 (94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45

s); 最后72 ℃延伸10 min。其余各序列的PCR反应条件、通用引物及扩增程序参考文献[12, 17−19]。PCR扩增产物经纯化后, 使用ABI 3730XL测序仪 (Ap-plied Biosystems Co., USA) 进行双向测序。

数据处理 测序峰图采用序列拼接软件CodonCode Aligner V 2.06 (CodonCode Co., USA) 校对拼接, 去除低质量序列及引物区, 利用ClustalX

V2.0 (Higgins D.G.) 进行多序列比对并查错。

对于ITS2序列, 拼接得到一致序列后使用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法, 去除两端5.8S和26S区段获得ITS2间隔区序列[20]。另外, 为了在重楼属更为广泛的范围内考察ITS2序列的鉴定能力,

作者从GenBank数据库中获得了重楼属的ITS2序列用于物种的鉴定效率分析。

17个实验样本所得各序列经ClustalW 1.83进行序列比对, 用PAUP 4b10 (Florida State University,

USA) 计算K2P距离, 对不同序列种间、种内变异大小进行比较。采用计算机Perl语言统计不同序列种间、种内遗传距离的分布频度, 评价不同DNA条形码候选序列的barcoding gap。最后采用相似性搜索算法 (BLAST1) 和最近距离法 (Nearest Distance) 考察序列的鉴定成功率[21]。

序列的一个重要指标, 各候选序列的PCR扩增效率,

matK较低, 为82.4%, psbA-trnH、rpoC1和ITS2均为100%, 经琼脂糖凝胶电泳得到PCR扩增电泳图 (图1)。测序成功率以psbA-trnH最低, 为76.5%, rpoB、rpoC1和ITS2均为100%。综合PCR扩增效率和测序成功率, 以rpoC1和ITS2序列最好, 均为100%,

matK序列最低, 为70.6%。

Figure 1 PCR amplification results of different loci. 1, 7, 13:

P. polyphylla var. Chinensis; 2, 8, 14: P. Verticillata; 3, 9, 15:

P. polyphylla var. pseudothibetica; 4, 10, 16: P. polyphylla var.

yunnanensis; 5, 11, 17: P. polyphylla var. polyphylla; 6, 12, 18:

P. vietnamensis

2 不同DNA条形码候选序列种内种间差异分析

在Meyer等[22]对DNA条形码序列变异分析方法的基础上, 引入“种间最小变异” (minimum inter-

specific distance) 以对应种内最大变异 (coalescent

depth)。对实验获得的重楼属不同DNA条形码候选序列的种内变异、种间变异、种间最小变异和种内最大变异进行分析。结果表明 (表3), rpoB序列的种间变异最大, 其次是ITS2序列, rpoC1序列种间变异最小。各序列的种内变异同样是rpoB最大, rpoC1和matK序列种内变异为0。在种间最小变异中, ITS2序列最大, rpoB序列次之, rpoC1序列最小。种内最大变异中, rpoB序列最大, rpoC1和matK序列最小,

psbA-trnH和rpoB的种内最大变异均超过了种间最小变异。

结果

1 序列信息、PCR扩增效率和测序成功率

各条DNA条形码候选序列的长度、GC含量统计结果见表2。各序列长度从232～1 037 bp不等, 其中ITS2序列最短, 为232～234 bp,psbA-trnH基因间隔区最长, 为1 023～1 037 bp, 其间隔区中含有编码基因rps19。各序列的GC含量也有不同, ITS2的GC含量最高,

达到57.3%,

psbA-trnH和matK则最低, AT含量接近70%。

PCR扩增效率和测序成功率是评价DNA条形码

Table 2 Identification efficiency of six loci using different methods for species identification

Markers

Length range /bp

GC content/%

Efficiency of PCR amplification/%

Success rate of sequencing/%

Relative identification

efficiency/%

Absolute identification

efficiency/%

Nearest Distance

Nearest Distance

psbA-trnH rpoB rpoC1 rbcL matK ITS2

1023−1037100

76.5

21.4

17.6

472 487 703 894−899 232−23494.1

100

37.5

35.3

100

100

5.9

5.9

88.2

93.3

7.1

5.9

82.4

85.7

50

35.3

100

100

100

100

33.0 39.6 44.0 43.1 32.0 57.3

BLAST1 21.4 37.5 5.9 7.1 75 100

BLAST1 17.6 35.3 5.9 5.9 52.9 100

朱英杰等: 重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究

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Table 3 Analysis of inter-specific divergence between congeneric species and intra-specific variation of candidate barcodes

Marker

All inter-specific distance

All intra-specific distance

Coalescent depth

psbA-trnH rpoB rpoC1 rbcL

0.005 7 ± 0.006 2 0.090 1 ± 0.071 60.004 6 ± 0.007 1 0.069 0 ± 0.076 20.004 6 ± 0.007 1 0.065 7 ± 0.077 70.000 3 ± 0.000 70

0.000 2 ± 0.000 70

0.001 8 ± 0.003 40.000 5 ± 0.000 80.000 9 ± 0.002 70.000 5 ± 0.000 8matK

0

0

ITS2

0.001 9 ± 0.001 7 0.049 4 ± 0.024 30.003 8 ± 0.003 50.004 9 ± 0.003 70.001 1 ± 0.001 5 0.035 4 ± 0.028 0Minimum inter-specific distance 0.001 7 ± 0.004 2 0.002 6 ± 0.003 6

理想的DNA条形码序列应当具有明显的种间变异, 同时种内变异足够小。通过重楼属各条形码候选序列的种内变异、种间变异、种间最小变异和种内最大变异分析发现, ITS2序列能够满足这一条件, 且种间最小变异明显大于种内最大变异。rpoB序列虽然种间变异最大, 但种内变异也很大, 容易产生错误分类与鉴定。

3 重楼属不同DNA条形码候选序列barcoding gap检验

理想的条形码种间遗传变异应明显大于种内遗传变异, 并在两者之间存在显著差异, 形成一个明显的间隔区, 即barcoding gap[17, 22]。重楼属不同DNA条形码候选序列barcoding gap图显示 (图2):

psbA-trnH、rpoB、rpoC1和rbcL序列种内和种间遗传变异重叠比例大, 无明显的barcoding gap, 相比来说matK、ITS2序列虽然barcoding gap不明显, 但种内和种间遗传变异重叠比例较小, 有利于区分物种。

4 重楼属DNA条形码候选序列鉴定效率评价

比较不同序列对物种的鉴定能力是评价不同条形码序列优劣的标准之一。相对鉴定成功率和绝对

鉴定成功率分别以测序成功样本和原始实验样本为基础。由表2可以看出, 通过BLAST1和Nearest

Distance方法均显示ITS2序列的鉴定能力最高, 达到100%, 其次是matK序列, 而其他序列鉴定效率均低于50%。为验证ITS2在更多样本中的鉴定能力, 加入从GenBank下载的28个物种 (含10个变种) 50条ITS2序列, 经BLAST1和Nearest Distance计算其鉴定成功率依然为100%。另外, 作者还比较了BLAST1

Figure 2 Relative distribution of inter-specific divergence between congeneric species and intra-specific variation

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和Nearest Distance这两种鉴定算法, 发现BLAST1算法在鉴定的准确度和计算速度方面优于Nearest

Distance算法, 因此BLAST1鉴定更具实用性。

条编码区序列, 也是多位研究者推荐的条形码序列之一[15, 17, 26], 特别是Lahaye等[17]通过对1 561种植物的matK序列研究表明, matK序列在种内变异、种间变异、barcoding gap和monophyly检验中具有很好的效果, 并提出390F/1326R引物在被子植物中较通用, 但其研究结果也受到一些学者的质疑, Fazekas等[24]对来自于32个不同属的92个物种的研究结果发现此引物的扩增效率只有88%, 且需要10对引物才能全部扩增。在重楼属中matK序列的扩增效率为82.4%, 实验中需进行2次PCR, 最终能够鉴定重楼属52.9%的物种。CBOL植物工作组通过对包括被子植物、裸子植物和藻类在内的550个物种的rpoB、rpoC1、rbcL、matK、trnH-psbA、atpF-atpH和psbK-psbI

序列进行研究, 发现单序列、双序列和三序列组合分别可达到最高69%、75%和76%的鉴定能力, 没有得

讨论

针对DNA条形码研究中的热点问题, 本实验以重楼属为研究对象筛选重楼属药用植物候选条形码序列, 并对DNA条形码技术在重楼属药用植物鉴定中的应用进行探讨。对于植物DNA条形码的研究,

不同学者提出了多条DNA条形码候选序列及不同的序列组合, 宁淑萍等[9]和Hollingsworth等[23]对此进行了较为详细的评述。

1 DNA条形码筛选标准及重楼属各序列优缺点比较

理想的DNA 条形码序列应能够使用单引物对进行扩增, 通过双向测序得到高质量的序列, 同时具有显著的种间差异和较小的种内变异[10]到理想的单序列作为植物的通用条形码序列, 最终推荐rbcL+matK的复合序列作为植物界的条形码,

其鉴定能力为72%, 但CBOL植物工作组认为这项重楼属rbcL序列扩增效率较高, 但结果并不完美[25]。其鉴定成功率只有5.9%, 且rbcL序列能够鉴定的物种matK序列也同样可以鉴定, 所以rbcL+matK复合序列对重楼属的鉴定能力没有提高。

2 ITS2序列在重楼属药用植物及药材鉴定中的作用

本实验通过对叶绿体及核基因组部分片段进行研究, 结果显示, ITS2在重楼属植物鉴定方面具有以下特点: ① ITS2序列两端的5.8S和26S序列都很保守, 便于通用引物的设计; ② ITS2序列较短, 在重楼属植物中约为200 bp, 降低了提取、扩增和测序的难度, Kress等[12]认为短序列更有利于获取发生降解的样本序列, 这对于DNA条形码在实际中的应用具有重要的意义; ③ ITS2序列能够与保守的5.8S和26S区段形成特定的颈环二级结构[20, 27, 28], Schultz等[11]建立的ITS2 数据库能够预测ITS2二级结构并对间隔区进行注释, 数据库已有216 374条序列得到预测,

这使ITS2序列的处理和分析更加准确可靠; ④ ITS2序列具有进化速率快的特点, 较高的变异程度使其在区分物种方面能力较强, Müller等[29]使用互补碱基替换 (CBCs) 方法对ITS2的鉴定能力做出评估, 得出ITS2序列具有足够的能力区分物种, Moniz等[30]使用5.8S+ITS2成功鉴定了硅藻属99.5%的物种。本。对重楼属不同序列分析发现, 综合PCR扩增和测序成功率、barcoding gap和鉴定成功率指标, ITS2较其他条形

码序列具有明显的优势, 自行设计的ITS2引物在重楼属中获得了100%

的PCR扩增效率, 测序和鉴定结果均达到100%

的理想值。psbA-trnH、rpoC1和rbcL虽然具有较高的序列获得率, 但其物种鉴定效率很低, rpoB因具有较大的种内变异不利于分类和鉴定,

matK序列在区分物种上具有一定的优势, 但受到扩增和测序的限制。

psbA-trnH、rpoC1和rbcL虽然在重楼属植物中鉴定能力较差, 但它们依然具有各自的特点。psbA-

trnH间隔区在被子植物中具有高度变异性物[12, 15, 24][12], 它

的两端具有75 bp的保守区序列, 便于设计通用引

, 在重楼属中的扩增效率达100%, 但其序[25]列较长、存在大量的poly (A) 结构域, 降低了测序的质量, 同时在不同物种中普遍存在插入/缺失的情况, 从而导致不同物种该片段长度变异较大, 难以进行比对, 给数据分析带来一定的困难; rpoC1序列长度集中在487 bp左右, 扩增和测序都能够顺利完成,

但序列非常保守, 缺少足够的信息位点; rpoB序列在序列长度、扩增和测序方面与rpoC1序列有类似之处,

不同的是rpoB在表3中各指标均显示具有高的种间变异, 但35.3%的鉴定成功率并没有反映出高指标序列应有的鉴定能力, 这可能与某些物种rpoB序列具有较高的进化速率有关。

matK序列是植物叶绿体DNA中进化较快的一实验通过对重楼属不同条形码序列进行比较, 筛选得到的ITS2序列成功鉴定了包括华重楼、滇重楼、七叶一枝花、长药隔重楼等重要重楼属药用植物。除

朱英杰等: 重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究

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少数重楼属物种外, 通过ITS2序列可将我国大部分重楼属物种区分开。

重楼为根茎入药, 而植物根茎经常存在寄生植物或真菌, 在提取样品DNA时进行前处理以避免霉变、虫蛀等问题。另外, 为了考察获得序列的正确性,

作者将所得序列与GenBank数据库进行比对搜索,

以保证序列未受真菌污染, 排除了“假阳性”数据的干扰。Chiou等[31]针对经过加工的药材专门设计了两对引物, 在48个科的55种药材中验证了其设计的ITS2引物具有较好的通用性, 本实验选取了2个滇重楼药材样本, 其ITS2序列得到成功扩增和测序,

说明应用ITS2序列鉴定药材具有可行性。

3 DNA条形码技术在药用植物鉴定中的应用

中药材传统鉴定方法如植物形态、显微结构、超微结构和化学指纹图谱等鉴定方法, 在中药材鉴定和评价其质量研究中发挥了重要作用。随着分子生物学技术的快速发展, 中药材DNA分子鉴定技术及基因芯片技术等也被广泛应用于中药鉴定, Sucher和Yip等[32, 33]对此做了详细的比较。在中药材中DNA序列鉴定以rDNA ITS序列的应用最为广泛, 但不同物种的鉴定所采用的引物不具有通用性, 不同物种鉴定结果无可比性, 使其鉴定受到制约。DNA条形码以一段短的基因片段作为通用序列进行鉴定, 能够在大的分类类群中形成统一的标准, 因此具有高通量、自动化、可靠性高等特点。陈士林等[34]Yunnan (云南植物研究), 2006, 28: 271−276.

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判明药材真伪, 尤其对于药材饮片和粉末, 可以不受性状限制, 对少量样品进行测试即可判定药材。通过对重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究, 将为药用植物鉴定、濒危物种保护以及资源评价等提供新的思路。

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