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2024年12月28日发(作者：tokenizer bert)
第
4
期
（
总第
525
期
）
2021
年
4
月
农产品加工
Farm
Products
Processing
No.4
Apr.
文章编号
：
1671-9646
(
2021
)
04a-0055-04
高效液相色谱测定
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力
程娇梅叫齐祥明巴
*
*
郭晓华
3
（
1.
中国海洋大学食品科学与工程学院
，
山东青岛266000
;
2
.
青岛蔚蓝生物股份有限公司
，
山东青岛
266000
;
3
.
山东美佳集团有限公司
，
山东日照
276826
）
摘要
：
D-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶可以将
D
-
果糖异构化生成
D
-
阿洛酮糖
。
为建立
D-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶
酶活力测定方法
，
首先建立了高效液相色谱法测定产物
D
-
阿洛酮糖含量的方法
，
进而测得
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构
酶酶活力
。
采用
50
mg/L
EDTA
钙溶液作为流动相等度洗脱
Waters
Sugar-Pak
I
色谱柱
（
柱温
90
流速
0.3
mL/min
，
进样量
10
z
L
），
采用示差检测器测定
D
-
阿洛酮糖含量
。
结果表明
，
该方法测定酶反应产物
D
-
阿洛酮糖含量得检
测限为
4.
12
mg/L
，
定量限为
1
0.3
mg/L
，
在
0.5~5.0
g/L
范围内线性度良好，
R
2
=
1
，
重复性
（
RSD
）
小于
1
.0%
，加标收
回率为
98.92%
。在此基础上进一步确定
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力测定时的酶反应最适温度
45
最适
pH
值
7.0
,
D
-
果糖底物质量分数
24%
，
反应时间
20
min
。
经检验
，
该酶活力检测方法的精密度
RSD
小于
5.0%
，
达
到酶活力检测要求
。
关键词
：
高效液相色谱法
；
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶
；
酶活力
中图分类号
：
TS241
文献标志码：
A
doi
：
10.
1
6693/.
167
1-9646
（
X
）
.2021
.04.014
A
High
Performance
Liquid
Chromatography
Method
for
the
Determination
of
D-psicose
3
-epimerase
Activity
CHENG
Jiaomei
1,2
,
QI
Xiangming
1,3
,
*GU0
Xiaohua
3
(1.
College
of
Food
Science
and
Engineering
，
O
cean
University
of
China
，
Qingdao
，
Shandong
266000
，
China
；
2.
Qingdao
Vland
Biotech
Inc.
，
Qingdao
，
Shandong
266000
，
China
;
3.
Shandong
Meijia
Group
Co.
，
Ltd.
，
Rizhao
，
Shandong
276826
，
China)
Abstract
：
D-psicose
3-epimerase
can
isomerize
D-fructose
to
form
D-Allulose.
In
order
to
establish
a
method
for
the
determi
nation
of
D-psicose
3-epimerase
activity
，
a
HPLC
method
was
established
firstly
to
determine
the
content
of
the
product
D-Allulose
，
and
then
the
activity
of
D-psicose
3-epimerase
was
determined.
A
Waters
Sugar-Pak
I
column
was
eluted
iso-
cratically
with
50
mg/L
EDTA
calcium
solution
，
the
column
temperature
was
90
无
，
the
flow
rate
was
0.3
mL/min
，
the
injec
tion
volume
was
10
jji
and
the
content
of
D-Allulose
was
determined
by
differential
detector.
The
results
showed
that
the
detection
limit
of
the
method
for
the
content
determination
of
the
enzyme
reaction
product
D-Allulose
was
4.12
mg/L
，
the
limit
L
，
of
quantification
was
10.3
mg/L
，
the
linearity
was
good
in
the
range
of
0.5
g/L
to
5
g/L
，
R
2
=1
，
the
repeatability
(RSD)
was
less
than
1.0%
，
and
the
recovery
rate
of
the
spiked
standard was
98.92%.
O
n
this
basis
，
it
was
further
determined
that
for
the
determination
of
D-psicose
3-epimerase
activity
，
the
optimal
reaction
temperature
was
45
无
，
the
optimum
pH
was
7.0
，
the
concentration
of
the
substrate
D-fructose
was
24%
，
and
the
reaction
time
was
20
min.
By
verification
test
，
the
precision
(
RSD
)
of
the
method
for
the
determination
of
the
enzyme
activity
is
less
than
5.0%
，
which
meets
the
requirements
of
the
en
zyme
activity
detection.
Keywords
：
high
performance
liquid
chromatography
(HPLC
)
;
D-psicose
3-epimerase
;
enzyme
activity
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶
（
D-psicose
3-ep-
imerase
，
DPEase
）
是一种酮糖
3
-
差向异构酶
，
可
以将
D
-
果糖转化为
D
-
阿洛酮糖叭
D
-
阿洛酮糖
是一种自然界中存在含量极少的稀有糖
，
其甜度相
0.3%
（
这一数值明显低于目前流行的代糖产品
，
木
糖醇
）
，
因此
D
-
阿洛酮糖具有降血糖比
影响脂肪
代谢X等生理功能
，
是一种潜在的可用于控制肥胖
和糖尿病
〔
"的新型低热量甜味剂叫目前
，
如果能实
现上述的
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶商业化生产
，
当于蔗糖的
70%
，
但能量沉积效率仅相当于蔗糖的
收稿日期
：
2020-09-27
基金项目
：
山东省重大专项项目"海洋食品加工副产物智能化全利用生产免疫增强饲料蛋白的关键技术与示范
”
（
2019JZZY010814
）
。
作者简介
：
程娇梅
（
1985
—
）
，
女
，
硕士
，
助理工程师
，
研究方向为食品成分分析与检测
。
*
通讯作者
：
郭晓华
（
1970
—
）
，
女
，
硕士
，
高级工程师
，
研究方向为食品加工工程
。
・
56
・
农产品加工
2021
年第
4
期
则有望实现该糖的大规模产业化生产
。
酶活力是酶制剂生产
、
应用中的关键定量指标
。
然而
，
目前关于
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活
力测定的方法报道还非常有限
。
尽管该酶相关的研
究文献提到了一些酶活力的测定手段
［
8-10
］
，
但大多语
焉不详
，
且不够严谨
。
因此
，
尝试基于该酶产物
D
-
阿洛酮糖的高效
液相色谱定量检测法的建立
，
确定该酶活力的检测
方法
。
D
-
阿洛酮糖和
D
-
果糖为
C3
位差向异构
体
，
结构和性质相似
。
因此
，
在酶活力测定的关键
在于通过高效液相色谱将底物
D
-
果糖和产物
D
-
阿洛酮糖分离
，
实现对
D
-
阿洛酮糖含量的精确定
量
。
在此基础之上
，
还对该酶的酶促反应条件进行
了系统的研究
，
进而建立了操作简单
、
准确可靠的
酶活力测定方法
，
为该酶制剂的生产技术开发提供
酶活力检测方法上的支持
。
1
材料与方法
1.1
材料与试剂
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶
（
液体
）
，蔚蓝生
物集团有限公司提供
。
D
-
果糖
（
M99%
）
、
D
-
阿洛酮糖
（
M98.0%
）
,
上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供
；
甲醇
、
ED-
TA
二钠钙
，
均为市售色谱纯
；
十二水合磷酸氢二
钠
、
二水合磷酸二氢钠
、
一水合柠檬酸，
均为市售
分析纯
；
去离子水
，
为自制纯净水
。
1.2
仪器与设备
E2695
、
2414
型高效液相色谱仪
，
美国沃特世公
司产品
；
PHS-3E
型
pH
计
，
上海仪电科学仪器股份
有限公司产品
；
TG16-WS
型高速离心机
，
湖南湘仪
实验室仪器开发有限公司产品
；
DK-98-IIA
型恒温
水浴锅
，
天津市泰斯特仪器有限公司产品
；
QT-1
型
漩涡混合器
，
上海琪特分析仪器有限公司产品
。
1.3
分析方法
1.3.1
酶活力定义及酶促反应步骤
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力定义
：
在一
定温度
、
pH
值条件下
，
每分钟生成
1
^mol
D
-
阿洛
酮糖的量定义为一个酶活力单位
，
用
U
表示
。
酶促反应步骤
：
取
4mL
—
定
pH
值
、
一定质量
分数的
D
-
果糖溶液作为底物
，
加入
1
mL
稀释好的
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶溶液
，
一定温度下水浴
反应一定时间
，
沸水浴
10
min
终止反应
，
冷却后用
高效液相色谱测定
D
-
阿洛酮糖含量
。
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力计算公式
：
酶活力
u
_
C
x
0.005
x
1
000
000
x
n
180.16
xtxm
式中
：
U
—
—
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力
，
U/mL
；
C
—
通过标准曲线算得的
D
-
阿洛酮糖质
量浓度
，
g/L
；
0.005
—
—
反应总体积
，
L
；
1
000
000
—
—
g
与憾的转换系数
；
n
—
稀释倍数
；
180.16
—
—
D
-
阿洛酮糖摩尔系数
，
g/mol
；
t
------
反应时间
，
min
；
m
------
样品的量
，
mL
o
1.3.2
D
-
阿洛酮糖含量测定
色谱条件
：
色谱柱为
Waters
Sugar-Pak
I
型色谱
柱
，
流动相
50
mg/L
EDTA
钙溶液
，
流速
0.3
mL/min
,
柱温
90
进样温度
25
检测器为示差检测器,
检测器温度
35
°C
,
进样量
10
“
L
,
运行时间
40
min
o
在该色谱条件下测定
D
-
阿洛酮糖含量
，
对该
方法的线性范围
、
检测限
、
定量限
、
重复性
、
加标
收回率进行试验
。
1.3.3
酶活力测定过程中最适条件探索
（
1
）
底物质量分数的确定
。
分别用
pH
值
6.5
的
缓冲液配制质量分数为
4%
,
8%
,
15%
,
30%
,
40%
的
D
-
果糖溶液
，
取
4
mL
底物溶液
，
加入
1
mL
酶液
（
此时的实际底物质量分数为
3
.
2%
,
6.4%
,
12.0%
,
24
.
0%
,
32.0%
）
,
在
45
°C
下进行酶促反应
30
min
,
测定反应液中的
D
-
阿洛酮糖产量
，
以确定底物质
量分数是否过量
。
⑵
最适反应温度的确定
。
用
pH
值
6.5
的缓冲
液配制质量分数为
30%
的
D
-
果糖溶液
，
分别在
30
,
35
,
40
,
45
,
50
,
55
,
60
,
65
,
70
°C
条件下进行酶
促反应
30
min
，
计算每个温度下的酶活力
，
做温度
-
酶活力曲线
。
⑶
最适反应
pH
值的确定
。
分别用
pH
值
4
.
0
,
5
0
，
6
0
，
7
0
，
8
0
的缓冲液配制质量分数为
30%
的
D
-
果糖溶液
，在
45
°C
下进行酶促反应
30
min
,
计
算每个
pH
值下的酶活力
，
做
pH
值
-
酶活力曲线
。
⑷
反应时间的确定
。
用
pH
值
7.0
的缓冲液配
制质量分数为
30%
的
D
-
果糖溶液
，
在
45
T
下
，
分
别进行
5
,
10
,
15
,
20
,
25
,
30
,
60
min
的酶促反
应
，
计算不同反应时间下的酶活力
，
做反应时间
-
酶活力曲线
。
1.3.4
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力测定方
法验证
选取
10
个不同酶活力的样品
，
用
pH
值
7.0
的
缓冲液配制质量分数为
30%
的
D
-
果糖溶液
，
在
45
°C
下进行酶促反应
，
计算每个样品的酶活力
，
重复测
定
5
次
，
计算其
RSD
o
2
结果与分析
2.1
D-
阿洛酮糖
HPLC
含量测定
通过前期试验确定较优的色谱条件为
Waters
2021
年第
4
期
程娇梅
，
等
：
高效液相色谱测定
D-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力
・
57
・
Sugar-Pak
I
型色谱柱
，
流动相
50
mg/L
EDTA
钙溶
液
，
流速
0.3
mL/min
，
柱温
90
°C
，
进样温度
25
°C
，
检
测器为示差检测器
，
检测器温度
35
°C
，
进样量
10
“
L
,
运行时间
40
min
。
果糖与
D
-
阿洛酮糖色谱图见图
1
。
果糖：
19.153
6O
6
2O
O
-20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
保留时间
t
/
min
图
1
果糖与
D
一
阿洛酮糖色谱图
由图
1
可知
，
在此条件下
，
D
-
阿洛酮糖在
25~
28
min
出峰
，
和反应底物
D
-
果糖
（
出峰时间在
17.5~
21.5
min
）
可以实现有效分离
。
进一步探索可知
，
D
-
阿洛酮糖的检测限为
4.12
mg/L
；
信噪比
（
S/N
）
=10
的
含量为定量限为
10.3
mg/L
；
在测酶活拟采用的产物
质量浓度范围
0.5~5.0
g/L
内
，
线性度良好
，
R
2
=1
。
验
证试验结果表明
，
此处建立的该糖检测方法重复性
（
RSD
）
小于
1.0%
；
加标回收率为
98.92%
。
2.2
酶活力测定过程中最适条件探索
底物质量分数
酶活力测量值关系见图
2
。
底物质量分数
/
%
2
底物质量分数
-
酶活力测量值关系
由图
2
可知
，
酶反应体系中底物质量分数为
3.2%~24.0%
时
，
产物
D
-
阿洛酮糖测量值随着底物
质量分数的增大而增加
，
这说明此时的底物质量分
数没有达到过量的程度
。
当底物
D
-
果糖质量分数
超过
24.0%
时
，
产物
D
-
阿洛酮糖测量值不再随着
底物质量分数增加而变化
，
说明当反应体系质量分
数超过
24.0%
时
，
底物质量分数达到了过量水平
。
因
此
，
从经济性和酶反应的可操作性角度
，
最终确定
反应体系内底物质量分数为
24.0%
。
底物质量分数再
高时
，
反应液黏度大幅度增加
，
不利于酶反应充分
进行
。
酶液酶活过高时
，
则进行适度的稀释后再进
行测定
。
温度
酶活力关系见图
3
。
由图
3
可知
，
温度为
30~45
°C
时
，
酶活力随温
度增加而增加
；
45
°C
时
，
酶活力达到最大值;
30
1
5
45~70
，
酶活力随着温度增加逐步下降
；
当温
度为
55
T
时
，
酶活力只有最高酶活力的
40%
左右
。
综上所述
，
45
°C
是该酶最适温度
，
也是酶活力测定
过程中所选用的温度
。
pH
值
-
酶活力关系见图
4
。
)()
8
0
6
_
0
H
4
0
W
M
-
0
0
____
_____________________________________
I
____
I
____
L
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
&0
pH
值
图
4
pH
值
-
酶活力关系
由图
4
可知
，
pH
值为
4.0~7.0
时
，
酶活力随着
pH
增加较快
值的增加而增加
；
pH
值
7.0
；
时酶活力测量值达到最大
而
pH
值为
5.5~7.0
时
，
酶活力
。综
上所述
，
pH
值
7.0
是该酶最适
pH
值
，
也是酶活力
测定过程中所选用的
pH
值
。
反应时间
-
酶活力测定值关系见图
5
。
7
T
U
5
_
-R
W
M
反应时间
t
/
min
*
-酶活力测量值
；
♦
-D-
阿洛酮糖
图
5
反应时间
-
酶活力测定值关系
由图
5
可知
，
反应时间在
5~20
min
时
，
酶活力
测定值和反应时间呈线性正相关关系
；
反应时间为
20
min
时
，
酶活力测定值达到最大
；
相应地
，
D-
阿
洛酮糖质量浓度和反应时间之间的关系也近似为线
性正相关
。
反应时间超过
20
min
后
，
体系中
D
-
阿
洛酮糖质量浓度趋于稳定
，
此时根据酶活力计算公
式测得的酶活力测定值随着反应时间增加而降低
。
这表明
，
在试验的酶反应体系中
，
当反应时间超过
20
min
时
，
酶反应达到平衡
，
此后时间延长将无法
・58
・
农产品加工
2021
年第
4
期
正确测得酶活力实际值
。
因此
，
为使操作过程时间
充足
，
最终确定
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活
力测定的反应时间为
20
min
。
2.3
D-
阿洛酮
3
-差向异构酶酶活力测定方法验证
在上述确定的酶反应条件下
，
试验对
10
个
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶样品进行了酶活力测定试
验
，
结果表明
，
RSD
值均少于
5.0%
（
见表
1
）
，
符合
酶制剂检测方法建立的要求
，
证明了高效液相色谱
法测定
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力的方法
准确可靠
。
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力检测方法验
参考文献
：
[1]
Kim
H
J
，
Hyun
E
K
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Kim
Y
S
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Characterization
of
an
agrobacterium
tumefaciens
D
-psicose
3
-epimerase
that
converts
D-fructose
to
D-psicose
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the
post
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-psicose
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borderline
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ingestion
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normal
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D
-psicose
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of
D
-fructose
，
sup
presses
the
activity
of
hepatic
lipogenic
enzymes
in
rats
[J]
.
证见表
1
。
表
1
D-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力检测方法验证
样品名称
A48
Asia
Pacific
Journal
of
Clinical
Nutrition
，
2001
（
3
）
:
酶活力
/
U-mL
"
1
8.06
RSD/%
8.61
15.38
18.95
8.18
16.09
8.10
8.252.63
3.04
[4]
233-237.
Kimura
T
，
Kanasaki
A
，
Hayashi
N
，
et
al.
D-Allulose
en
hances
postprandial
fat
oxidation
in
healthy
humans
[J]
.
A64
A72
A144
A160
B88
15.20
19.57
15.87
18.69
15.61
20.86
30.41
37.14
20.20
33.04
36.27
24.73
4.42
Nutrition
，
2017
（
43-44
）
:
16-20.
33.58
35.05
23.69
24.26
50.69
32.97
34.65
25.31
31.89
34.83
22.91
3.49
3.27
3.84
[5]
Akram
Hossain
，
Fuminori
Yamaguchi
，
Kayoko
Hirose
，
et
al.
Rare
sugar
D-psicose
prevents
progression
and
develop
24.95
26.06
49.27
B96
B112
B120
B136
25.89
26.23
26.58
4.70
ment
of
diabetes
in
T2DM
model
otsuka
long-evans
tokushi
ma
fatty
rats
[J]
.
Drug
Design
，
Development
and
Thera
-
48.25
81.49
118.67
51.10
80.51
49.83
80.42
2.56
1.93
2.84
79.02
112.52
78.45
120.86
py
，
2015
（
9
）
:
525-535.
[6]
Han
Y
J
，
Han
H
J
，
Kim
A
H
，
et
al.
D-Allulose
supple
117.94
115.43
mentation
normalized
the
body
weight
and
fat-pad
mass
in
3
结论
diet-induced
obese
mice
via
the
regulation
of
lipid
metab
-
olism
under
isocaloric
fed
condition
[J]
.
Molecular
Nutri
采用
Waters
高效液相色谱仪
（
E2695
，
2414
）
Waters
Sugar-Pak
I
型色谱柱测定
D
-
阿洛酮糖含量,
该方法的检测限为
4.12
mg/L
，
定量限为
10.3
mg/L
，
在测酶活拟选产物质量浓度
0.5~5.0
g/L
范围内线性
度良好
（
R
2
=1
）
,
重复性
（
RSD
）
小于
1.0%
，
加标收
回率为
98.92%
。
在高效液相色谱法测定
D
-
阿洛酮糖含量的基
础上
，
建立了
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力
测定方法
，
从底物质量分数
、
温度
、
pH
值
、
反应时
间等方面考查了这些因素对
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异
构酶酶活力测定的影响
，
确定了底物质量分数为
24%
D
-
果糖溶液
，
最适温度为
45
T
，
最适反应
pH
值为
7.0
,
反应时间为
20
min
。
在该条件下，
对
D
-
阿洛
酮糖
3
-
差向异构酶酶活力测定方法进行验证
，
10
个
样品的
RSD
均少于
5.0%
，
说明高效液相色谱法测定
D
-
阿洛酮糖
3
-
差向异构酶酶活力准确可靠
。
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tion
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Food
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1
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Matsuo
T
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Suzuki
H
，
Hashiguchi
M
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D-psicose
is
a
rare
sugar
that
provides
no
energy
to
growing
rats
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Zhu
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Overexpres
sion
of
D
-psicose
3
-epimerase
from
Clostridium
cellu
-
lolyticum
H10
in
Bacillus
subtilis
and
its
prospect
for
D
-
psicose
production
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Dan
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Character
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novel
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-epimerase
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clostridium
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Lingqia
Su
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Fan
Sun
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Zhanzhi
Liu
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Highly
efficient
production
of
Clostridium
cellulolyticum
H10
D-psicose
3
-
epimerase
in
Bacillus
subtilis
and
use
of
these
cells
to
pro
duce
D-psicose
[J]
.
Microbial
Cell
Factories
，
2018
（
17
）
:
188-196.
◊
声.•十"十"十"十"十"十"十"十"十••十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十••十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十"十
”
十"十"十
”
十"十"十
”
十"十"込
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