不可忽视的转膜和封闭WesternBlot专题(经验篇).

不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)

生物通技术专题：既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是

最通用的方法。Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，

转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样一个也不能

少。如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。

“工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先

来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。

Western 印迹的仪器主要就是电泳系统和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-Rad和

Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，

也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选

呢。

一、Bio-Rad经典Mini系列

Bio-Rad Laboratories由 David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创

建，总部位于加州 Hercules，下设三大部门——生命科学部，临床诊断部和工业材料部，

其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识

产权限于困境的MJ Research，使得伯乐在PCR领域的市场份额骤然扩大。Bio-Rad生命科

学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实

验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。只要是提到SDS-PAGE，Bio-Rad绝对是

每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。

Mini-PROTEAN3电泳系统与Mini

Trans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。自上个世

纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离

蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展， SDS-PAGE电泳技术已经基本成熟了。而且在

操作手段方面也越来越简便，越来越准确。Mini Protein Cell的出现使得Western的制胶和

电泳的消耗成本更经济、操作更简便快速——这种简便也间接促进了Western技术的更广泛

采用。而Mini-PROTEAN 3 自被生产出来那天就可以说是“踩在巨人的肩膀上”，因为它吸

取了Bio-Rad之前第一代和PROTEAN 2微型垂直电泳仪的优点，并在其基础上进行了优化，

所以获得了全球实验人员广泛的认同与喜爱。

Mini-PROTEAN 3的优点可以概括为8个字——用途广泛，操作简便。由于

Mini-PROTEAN 3可以用于SDS-PAGE变性电泳、非变性电泳、Tric-Tricine电泳、等电聚

焦和酶谱分析，以及dsDNA、ssDNA和RNA的电泳分离，因此可以说只要实验室有一套

Mini-PROTEAN 3，足以应付常规垂直电泳需要了。Mini-PROTEAN 3体现了Bio-Red不断

改进的努力方向——设计人性化，令操作更简便——这在各个细节都可以体现，比如说为了

防止制胶过程出错，Mini在玻璃板，夹合器（固定玻璃板的装置）以及电泳槽里等处分别

都有注明正反位、夹板高度或正负极；方便的夹子取代了以前需要拧4个螺丝来固定玻璃板

的麻烦。由于未交联的聚丙烯酰胺本身是神经毒素，因此每个实验者都希望操作能简单快速，

尽可能减少讨厌的意外“事故”——漏胶的发生。Mini-PROTEAN 3巧妙的设计使得配胶快速

方便的同时更大大减少漏胶的几率。除此之外，Mini的加样容量也是可以多样选择的，包

括10-well (30 µl)，15-well (15 µl)，10-well (50 µl)，12-well (20 µl)，9-well (30 µl)，IPG comb

(7 cm IPG strip)。

电泳结束后就要转膜。同系列的Mini Trans-Blot可以说是Mini-PROTEAN 3的“完美拍

档”，它们组合在一起就是做Western印迹实验的最好选择之一了。说它好，当然是有原因

的，由于Mini Trans-Blot在转移过程当中的三个关键步骤里设计巧妙，帮助转移顺利进行，

提高了转膜效率，因此才会得到如此多的用户的赞赏。第一就是在夹板盒，由于转膜过程中

的气泡问题对于实验结果有很大的影响——试想一下，在特异带显色处正好有一个气泡，那

么本来可以很漂亮的结果就付之一炬了，甚至可能会造成假阴性结果。Mini Trans-Blot的夹

板盒通过两块海绵与封口式设计帮助减少气泡的存在，同时夹板盒多孔的设计也可以在压制

过程中使缓冲液均匀的渗出，减少气泡。其次，转膜槽的人性设计。试问一下，在转膜中最

怕什么，我想大部分人都会说是正负极弄错，Mini Trans-Blot为了防止这种造成整个实验完

全失败的情况出现，在转膜槽的正负极上明确的用大范围的红与黑这两种颜色标志出来了，

这样出错的可能性就大大降低了。第三，就是Mini Trans-Blot的冷却装置。Mini Trans-Blot

有一个冷却盒，听起来好像很复杂，其实就是一个塑料盒子，但是这个盒子在转膜过程中却

可以起重要作用，众所周知，转膜过程中发热不仅会造成气泡的形成，而且很有可能会影响

蛋白的正常转移，因此大多数转移是在冰上进行的，但由于空气的隔热现象往往效果不是很

明显，利用Mini Trans-Blot，实验人员可以在冷却盒中装入缓冲液将其冰冻起来，转膜时就

可以起到冷却的作用。除了以上这些，Mini Trans-Blot还有一次可以转两块膜，低电压过夜

转膜以及令人放心的外观设计等方面的优点。Mini-PROTEAN 3加上Mini Trans-Blot一套价

格不便宜，要1000多美元呢。现在那个超薄硬质玻璃板也可以单买了，以前可是十套打包

的。

Bio-Rad除了这个“镇店之宝”外，还有适合于13.3 x 8.7 cm gels的Criterion系列（Mini

系列是8.6 x 6.8 cm），这一系列无论是电泳系统还是转移系统都和Mini相似，但是它可以

容纳更多块胶，为蛋白质组分析提供便利。而且有线电极和板电极两种方式供选择。除此之

外，还有更大尺寸的the Trans-Blot Cell(16 x20cm，26.5 x28cm)适合特别的需要的实验来选

择。

二、电泳世家Hoefer

也许国内的研究人员不那么熟悉Hoefer，但是这个1967就成立的公司在电泳产品领域可

谓赫赫有名。多年来一直专注于核酸和蛋白电泳分离技术，使得其产品质量和设计一直处于

领先地位，在国外真正属于“顶级”口碑的电泳产品。被GE收购了的Amersham则是大家非

常熟悉的品牌（包括独步天下的原法码西亚的蛋白纯化王国），而多年为Amersham代工生

产单向电泳产品的正是Hoefer。2003年Hoefer成为著名的哈佛生命科学全资子公司，GE

（Amersham）目前继续销售Hoefer的各种产品，而且8月期间还有6到7折的特别优惠，

很值得看看（点击这里）。老实说GE的这一单向电泳系列一直算是良心价，和美国Hoefer

的价格差不多，如果算上这么大的折扣优惠，在美国也买不到这个价格呢！

GE（通用电气公司）有一个很有名的创始人——托马斯·爱迪生，自1896年爱迪生电灯

公司和休斯顿电气公司合并成立GE公司以来，GE秉承着“梦想启动未来”的理念逐渐成为

了一家多元化的科技、媒体和金融服务公司。2004年4月，GE宣布成功收购Amersham公

司所有股票，自此GE Healthcare在生命科学领域的发展生机勃勃，充满朝气，继续拓展

Amersham在基因组，蛋白质组，分离纯化，检测试剂等领域打下的王朝。

在蛋白电泳与印迹系统方面，Amersham做得标准全面，有各种的可以放置不同凝胶数目、

凝胶面积和厚度的电泳槽可供选择，通常可以分成三类：微型、中型和大型，另外电转印迹

系统也有多种选择，比如说如果你想做半干转移，那么就可以选择Hoefer TE70或Hoefer

TE77，如果是要做全湿转移，那么Hoefer TE22或TE62是可以考虑的购买对象。所以如果

你刚开始接触蛋白电泳和Western印迹，那么可以考虑一下GE公司（Amersham）的产品，

因为这些产品不仅购买放心，而且在产品服务方面也相当不错，能够找到众多有用的资料。

别具一格Hofer MiniVE

Amersham在电泳仪器方面挑选范围广，而在蛋白垂直电泳系统中一定要提及的就是

Hofer MiniVE了，这一设计完整、使用方便的新一代电泳仪器融合了蛋白电泳与Blot两方

面装置配备，设计独特，而且在前一段时间GE公司大减价活动中，全套MiniVE只要560

美元，只用花一套仪器的钱就可以用作两种用途，这么著名的品牌，真是难得物美价廉啊（如

果连同电泳电源还可以再打折哦，晕...）。

说它是好货，那么到底MiniVE是好在哪儿呢？其实在众多电泳仪器倍出的江湖，MiniVE

有三招让其独步武林，第一招就是操作简便，节省时间。由于有时蛋白电泳使用频率很高，

所以实验人员当然会希望操作简单啦。MiniVE配胶过程就三步：load→ clamp→cast，只需

把玻璃板放上去，夹紧，然后灌胶就完事了。漏胶？那是极少发生的事。细微之处见真功，

MiniVE的设计有一些过人之处。比如Spacer有T边，大大减少侧边漏胶的几率；而将玻璃

装到模块上的时候，两边底部的玻璃/Spacer/玻璃处都有Guide Foot，顶一下“三件套”的上面

就可以保证足部完全对齐防止底部漏胶。装玻璃的时候如果传统的“插进模块”就容易导致

Spacer和玻璃之间“走位”，MiniVE的模块两个侧边和底部都可以打开，将装好的玻璃平放，

合上夹边再拧螺丝就行；底部的封边也很特别，有3档，一个是密封档，可以密封底边后直

接倒胶；一个是半开的电泳档，允许电泳液均匀连通胶底部，另一个当然就是完全打开以便

装卸玻璃了。所以MiniVE并没有单独的倒胶架子，将底部封条推到密封位置后就可以将模

块“挂”在电泳主槽的边上倒胶了，不用担心胶面不平哦。Amersham产品做工精良，值得信

赖的。

第二招，高品质大容量。MiniVE与一般蛋白电泳相比，有个很大优势，就是其蛋白胶可薄

至0.5mm，而且凝胶大小是10×10.5cm(W×H)，比一般的10×8cm要长了30%，这样的好处

就是增加了蛋白分辨率，使一些“难舍难分”的蛋白组分“分道扬镳”，达到更好的分离效果。

ViaFect转染试剂

第三招，Western印迹，MiniVE采用的转移槽是“盒式”的，润湿的转移膜和滤纸、海绵组成

“三明治”结构夹在“盒式”的转移模块中，闭合后每个转移模块只用350毫升的缓冲液，放入

主槽中；而电泳主槽里只放预冷的去离子水作为降温，就可以直接转膜了。这种转移方法不

用整个电泳主槽装满电泳转移缓冲液，可以节约不少缓冲液（1.2—1.7升）呢，而且可以减

少不均匀的发热。

Amersham除了这种微型的电泳系统，还有Hofer其它系列，比如SE250垂直电泳仪，这种

电泳系统配有热交换模块，可以消除smile现象（一种由于热量交换不及时而引起的蛋白带

波动现象，生物通注）。再比如凝胶大小为18×16cm的SE600 Ruby，以及为了蛋白质组学

研究的需要开发的Ettan DALT six和Ettan DALT twelve，这两种电泳系统分别可以进行6

块和12块凝胶的电泳，这可以说是“库斯拉级”的电泳系统啊！

三、国产品牌

国产电泳仪，国内的老牌六一是大家非常熟悉的产品，价格的绝对优势令其历时数十年

而屹立不倒。电泳仪这玩意本来技术含量不比芯片扫描仪什么的，只要设计合理好用，电极

丝笔直耐用分离效果好，塑料槽晶莹剔透美观易清洗，价格合理就好。国内品牌现在材料都

没话说，高透明度聚碳酸脂注塑成型，铸造模具非常精密。关键就是设计，好不好用，分离

效果好不好。最近新冒头的后起之秀，北京百晶生物技术有限公司的产品就值得关注--越是

新出品的电泳槽，在设计上就越值得期待，无他，只因具体设计上可以参考其他著名品牌优

缺点，扬长避短，结合更多使用人多年的心得和期望进行改进--站在巨人的肩膀上自然有高

度。

这个百晶其实是美国海湾基因集团公司在中国设置的以出口为主兼顾国内市场的外向型

生产加工基地，专业研发和组装生产“Baygene”品牌电泳及配套仪器，将美国工程师的人性

化设计理念和国外制造的高精度模具组合起来，核心进口器件及不同程度的国产化率集成的

国产货。包括高、中、低压电泳仪电源；垂直、水平电泳仪；可整支高温消毒的移液器；超

薄型磁力搅拌器；手掌式、台式离心机；高精度恒温循环器；常温、低温干式恒温器；显微

镜数码图像系统等。其中最为值得称道的就是Baygene BG-verMINI 迷你垂直电泳仪。因为

设计更人性化，操作更简便。

1．首先，跑蛋白电泳最重要是必须效果好。 BG-verMINI 迷你垂直电泳仪（标配）凝胶尺

寸是82×97mm(W×H)，分离长度比一般迷你型凝胶82×73cm长25%。由此增加了蛋白分辨

率，分离了粘连的蛋白组分。同时又可以兼作82×73cm迷你型凝胶，达到省时省液、快速

方便的效果。兼顾到了多种使用习惯。

2：其次，只是效果好就可以吗？在当今越来越讲究效率的今天光是效果好还不够，还得必

须操作简单不漏胶。那么让我们来看看 BG-verMINI 迷你垂直电泳仪如何实现简单方便的。

它具有独特的灌胶装置，可同时灌1-2块胶。制胶过程只需三步：把带固定垫条的玻璃固定

在主槽上，再将主槽放在独特的灌胶装置上，即可完全放心的灌胶。任何人都能在1分钟内

操作完成，没有任何漏胶的可能。凝胶制成后卸掉灌胶装置，凝胶板无需二次移动（不用拆

下玻璃板），将主槽整个放入壳体中即可电泳。最大限度避免了玻璃板移动过程的失误以及

凝胶渗漏等等。在国内外相关产品都需二次移动的情况下，此特点更加彰显突出和有效。

3．液体搅拌：槽体底部留有1cm空间，便于电泳或转印时放置磁力棒进行搅拌，以使温度

和离子强度均匀，实现电泳或转印的最好效果。若不用此功能时，可放置减液板（电泳配件）

填充其空间，以减少缓冲液量。

4．充分接触：电极的正极结构为V字形设计，两侧有气泡出孔，电泳时不会有气泡在电极

周围存留，保证了电极与缓冲液的充分接触，达到了散热的良好效果。

5．缓冲液量自由放置：槽体宽大，充分达到了足量缓冲液带来的极佳散热效果。既避免了

用户自制“冰盆”冷却的尴尬， 又避免了凝胶谱带的“笑脸”现象。需要节省缓冲液时，减液

板又可以发挥作用啦。上下槽合计最低缓冲液量为400ml。

6．多板制胶：需要提前制成大量凝胶板冷藏保存的用户，我们也准备了多板制胶器供选择，

每次可制4块凝胶。

7．转印电泳：配套的聚碳酸脂模具成型BG-blotMINI迷你转移槽，内置冷却装置—冰盒，

其快速吸收了转印过程的热量，克服了无冰盒转印的发热现象。具有限位功能的转移槽，配

以颜色明显的转印夹和电极，确保了转印过程的正确定向。

生物通Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜

PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防

止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的

比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过

硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP

扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——

胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子

——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值

得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺

母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带

清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，

不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制

胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人

的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么

豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配

好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性

循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可

是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了

新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就

没有一点非份之想的冲动？

上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地

“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer（别

小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，

你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。

电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再

进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济

通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng

蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot

实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可

以说明问题。如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPRO Tangerine——这种金色荧光

蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于

不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变

性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。可惜SYPRO

Tangerine价格挺贵的，500ul（5000x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。

所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰

Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。

转膜：经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜

上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下

已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是

画家在画布上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。Western

Blotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的

转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实验。

Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，

NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白

印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力

（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.

不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有

其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像

国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。

首先来比较下这几种膜的特点

NC膜

尼龙膜

PVDF膜

灵敏度和分辨率

高

高

高

背景

低

较高

低

结合能力

80－110 ug/cm2

>400 ug/cm2

125－200 ug/cm2（适合于SDS存在

下与蛋白质的结合）

材料质地

干的NC膜易脆

软而结实

机械强度高

溶剂耐受性

无

无

有

操作程序

缓冲液润湿,避免气泡

缓冲液润湿

使用前100%甲醇润湿

常规染色， 比较于NC膜，可用考马斯

检测方式

常规染色，可用放射性和非放射性

检测

不能用阴离子染料

亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫

检测。

0.45um 一般蛋白

适用范围

0.2um一分子量小于20kD蛋白

0.1um一分子量小于7kD蛋白

低浓度小分子蛋白、

酸性蛋白、糖蛋白和

蛋白多糖(主要用在

糖蛋白检测和蛋白质测序

核酸检测中)

价格

价格较便宜

便宜

较贵

1. 硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用

于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背

景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润

排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要

特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，

Schleicher & Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年

依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot结果。不过要注意的是纯的

硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经

不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白

用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um

的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降

低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最

好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。

硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是 Schleicher & Schull；Millipore；PALL，另外罗

氏、Invitrogen、GE（Amersham）、Santa Cruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM

的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。 Schleicher &

Schull的名字拗口——那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同速度的上下往

返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个提供硝纤膜的厂家依然广

为人知，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：Protran nitrocellulose membrane和Optitran

nitrocellulose membrane。前者Protran一直是 Schleicher & Schull自豪的产品，这种“100%

Pure Nitrocellulose Membranes”。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增

加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些

醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。而Protran在制作过程中去除了各

种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。除了这一点以外，Protran还有低背景、

多孔径选择（0.45, 0.2, 0.1um）和保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年！真

是“路遥知马力”的典范）等优点。但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，

需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以

耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。

Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果表面看起

来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增强

这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗脱的

实验。不过有的使用过的人反应不如纯NC膜结合能力强。 NC膜除了一般的Discs、Rolls

和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种方便顾客使用的“sandwich”三明治形，

十分有趣。说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就是将滤纸和NC膜纸套

成滤纸—NC膜—滤纸的层迭形式，预先切割装订好，方便使用。不过，卷膜肯定是最实惠

的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。不知道为什么在国外硝纤膜会

被当作危险品来运输还要加收运费，所以货期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用n年——如

果非要给这个n加个期限，那就是......至少可以用到等我毕业之后。

2. PVDF膜

刚开始做WB的人也许会有这种疑问：为什么实验室的老师（或者师兄师姐们）在教我

们做WB的时候，如果是用PVDF膜做，总是小心翼翼的剪，节省着用，甚至一些边边角

角也舍不得丢掉呢？其实，这不仅是因为PVDF膜比较贵，还由于PVDF膜是做WB的“杀

手锏”。

聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。与硝

酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能

（Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量

是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清学检

验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗

体检测糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化

学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳

道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/肽分

离/内部测序和免疫检测（Kurien,et al.,2003)。特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”

的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。

所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。此外，个人经验，一些强疏水蛋白用PVDF膜

效果会更好一些。PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染

色都一样OK，但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）

再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这

种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影

响后继的抗体识别呢）。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白

有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

PVDF膜常见的有以下几个品牌

公司

产品名

孔径

适用范围

参考价格

Millipore

Immobilon Transfer

Membranes

0.45um0.2um

$212

Bio-Rad

Immun-Blot PVDF

Membrane

Chemiluminescent,

colorimetric western

blots,amino-terminal

sequence and total amino

acid composition

Pierce

PVDF Membrane

0.45um0.2um

Western, Southern,

Northern, and dot blots

Pall Life

Science

BioTrace PVDF Transfer

Membrane

0.45um

Nucleic acid and protein

transfers. Protein sequencing

$149

Invitrogen

PVDF Membrane

0.45um

0.2um

Protein

sequencing,immunoblotting

￥1625.8

Whatman

Westran Clear Signal

PVDF Membrane

0.45um

Western blots

作为PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分为Immobilon-P（0.45um）,

-PSQ(0.2um), -FL(用于荧光显色)和Blotting Sandwiches for High Troughput四种。

Immobilon-P膜孔径均一，具有极强的吸附能力，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高，

有助于提高检测灵敏度，而且开放的孔结构容易接近被吸附的蛋白质，并有助于去除背景上

没有吸附的探针，可以说是免疫印迹检测理想的印迹膜。Immobilon-PSQ转印膜是印迹小分

子蛋白质（<20KDa）的理想选择——优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。内表面面积较大，

可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。由于不含污染性支撑物或表面活性剂，

Immobilon-PSQ层析谱上的背景峰值极小。Immobilon-FL也是Millipore值得骄傲的产品，

因为这是第一个专门为荧光显色优化的转移膜。通过实验证明，这种膜在Kodak成像系统

可以显示仅7ng的蛋白，听起来不错吧，有兴趣可以试一试。这几种膜除了一般的PVDF

膜的优点之外，最大特点就是一个字——快。按照Millipore的操作手册，Immobilon可以在

保证质量的前提下缩短WB时间到2个小时——主要是缩短封闭和洗脱时间。这可真是个

好消息，因为坐在那儿等WB结果多浪费时间啊！缩短这个费时而枯燥的过程，早出结果，

可以提高实验效率，利于我们分析实验结果，考虑下步对策嘛。卷膜经济实惠，裁剪剩下的

边角料还可以用来做点杂交，而预裁剪的即用膜更适合高通量等等“用金钱换时间”的实验。

再次强调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理

几分钟，待膜变成半透明后用MilliQ水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。

Invitrogen公司的PVDF膜也有大家风范：膜是与两张预裁的滤纸同时提供，方便使用；

虽然一般而言0.2um的膜渗漏少适用性会更强，但Invitrogen的 0.45umPVDF膜自有自家优

势——特别适合于低背景，高敏感度的印迹反应，同样需要在乙醇或者甲醇，或者异丙醇中

浸泡5分钟就可以用了。

免费索取Affymetrix基因芯片资料信息

3. 尼龙膜

尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如dot blot，比较于NC膜来说，

它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高——

由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方

法，背景问题尤为突出（据分子克隆III说通过热处理的酪蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮延长

封闭时间可以改善），而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏（通

过甲醛固定可以缓解这一情况）。另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。因此在许

多情况下实验室人员进行WB实验不选择尼龙膜。

尽管如此，一些产品却能“取其精华，去其糟粕”，将尼龙膜一些不利于蛋白印迹的因素

缩小或者去除，使其成为有效的蛋白转移介质。比如说，化学发光底物做得相当出色的Pierce

公司，其旗下的Biodyne A&B Nylon Transfer Membrane就是这样一个产品。这种分为A，B

两型的尼龙膜做工精良，孔径大小一致，为了保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃背景影响大

的缺点，Biodyne采用了合适的signal-to-noise 比例来调整，从而达到了200ug/cm2的蛋白

结合能力，同时有比大多数尼龙膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此之外，B型的

Biodyne对于一些带负电蛋白是一种理想的转移膜，因为它在A型的基础上提高了正电荷集

团的浓度。另外Biodyne相对于NC膜来说还是一种“打不怕，撕不烂，烧不着（200℃一下）”

的“顽强”的转移膜。

摘要：

选好了膜，就该考虑如何做转膜了。经典的转膜方法是电转移。如何做这个“海绵—几

层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海绵”的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的介绍。下

面我们就来谈谈一些需要注意的细节。

续前：选好了膜，就该考虑如何做转膜了。经典的转膜方法是电转移，这个生物通在前面的

WesternBlot仪器之选里面有提到过，因为电转移需要配套垂直电泳槽来进行。如何做这个

“海绵—几层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海绵”的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的

介绍，相信大家都很容易找到。一些细节：

1. 记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰

胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体，可不要这样白白为科学献身哈）

如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件

（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；

去掉积层胶后，预染的Marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面（预染Marker

如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以

看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加1—2倍的量）；如果目标

蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶

上下方向，切个小角是常用的方法。膜上要做好标记，识别正反面和上下。剪一个小小角最

方便。膜和滤纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+尺子

+垫厚报纸划比较容易）尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。

我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。

2.

3.

4. 对于特别小的蛋白，tricine SDS-PAGE电泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD间

的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高（可参考2004年中国生物工程杂志上

有一篇文章（有效分离1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法），87年m也有一

篇文献）。

转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转

膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。

膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气，膜

彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的。最

后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。以后的步骤中不要让膜干涸了，

万一不幸发生也用同样处理。

电转移缓冲液通常用Tris glycine系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白测序，最好

用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。

半干电转移（Semi-Dry）用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，

而且效果也好。由于不用“泡”在缓冲液中，半干转不单可用均一缓冲体系，也可以做非均一

转移缓冲体系（配方下面有，还可以加

20 % (v/v)

甲醇，据说有助于增加转膜效率和减少胶

变形的，但据说也有可能影响抗体识别）。半干转可以在30分钟内完成转膜（每平方厘米

电流2.5—3.5mA，恒流，冷库。如果电流要求小可以延长到60—90分钟，但要防止过热。

如果有那种温度贴，可以贴上参考温度），即使205KD这么大的蛋白转膜效率也高达80%。

各种大小的蛋白的转移效率都OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转（面积还是按照

单个计算），或者并排放（2块胶的面积计算），只要控制好单位面积的电流强度和时间，

防止过热就好了。

Discontinuous blotting buffer to be used:

Anode buffer I:

Anode buffer II:

Cathode buffer:

300 mM Tris

30 mM Tris

25 mM Tris/HCl (pH 9,4)

40 mM 6-Aminocapronic acid

5.

6.

7.

8.

9.

10.

有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为SDS等去

垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而不好。

如果只做Western Blot，膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应

影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用

针或者笔扎眼记录条带位置，以免后面会洗掉而无法判断结果。预染Marker也有助于判断

转膜的效率和情况，如果比目标分子大的Marker都已经转过去了，那就OK了。如果有能

在Western结果显色的Marker（比如生物通前面特别推荐的别出心裁 特别好用的蛋白分子

量标准 谁可小看“蛋白标准”（下） ）就更方便了。

有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序，如果要蛋白测序需要提前一天倒胶，并

说预电泳6小时（有还原剂如Glycolate）后再倒积层胶。除了要做HPLC分析应该用丽春

11.

12.

红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测序和或者PTH都可以选灵敏度高

些的考马斯亮蓝或者氨基黑。没条件做，参考而已。

13. 转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透

明的蛋白条带，有时这种快速的方法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。

转膜后的封闭注意：

14. 转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限

于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方（实验太晚了还可以补充一下营养，哈哈），

用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物

素—亲和素的检测方法（如果用了生物素标记的Marker而且结果背景较高，分析结果也有

可能是受此影响），脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。如果采用碱性磷酸酶检

测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65

度1小时确保碱性磷酸酶失活（可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好）。经济的脱脂奶配方和

AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。

但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不

要加叠氮化钠为好。切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活

了。

如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS

干扰AP。再想起什么再补充吧。下一篇转到显色试剂的选择了。

蛋白质marker

“大”与“小”的界定真的很难，有时看起来就是无关紧要的细节却偏偏对于结果的影响最大，比如

“发现号”的一块隔热材料松脱就有可能造成无法弥补的后果，再比如以前所认为是“垃圾”的

DNA却作用强大，还有小小microRNA对整个分子生物学的影响犹如“麦莎”台风过境，可见千

万不可忽视任何一个细节。在Western Blot过程中，分子量Marker就是这样一个小细节。这个

Western Blot参照家族的一员（见Western Blot 为什么必须用内参？)的作用主要是用来指示

蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白

标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker

也是Wb实验成功的必要条件之一。

环顾各个厂家，蛋白标准分子量产品争奇斗艳，各式各样，但总的来说可以分成未染蛋白分

子量标准、预染蛋白分子量标准和修饰标记蛋白分子量标准三个级别，除此之外还有一些特殊的

蛋白分子量标准。说起蛋白Marker这东西，想一想好像挺简单，但为什么会有不同的厂家不断

推陈出新呢，到底新技术会给我们带给如何的便利呢，还是让生物通“一览众山小”，为您做个

scan。

一. 未染色（pre mixed）蛋白分子量标准

未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记

分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选

用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指

15.

示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条！数到眼都花了。所以当看到特别浓的

那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，

当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不

幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染

Marker（pre-stained）好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色

才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做

对照的要好。预染Marker要看下集啦。

① 宽分子量蛋白标准

厂家 产品名

Protein

Ladder(kD)

包装价格 用量

0.56ml ￥335

NEB

Unstained

Protein Marker

212, 158, 116, 97,

66, 56, 43, 36, 27,

20, 14, 7, 2/3

1.12ml ￥756

5.6ml ￥3024

Mini-gel 7ul/well

Full length-gel

15ul/well

Protein

MBI

Molecular

Weight Marker

116, 66.2, 45, 35,

25, 18.4, 14.4

Mini-gel 5ul/well

2×1ml ￥420

Full length-gel

10ul/well

GE

Full MW Range

10－250

500ul $201

SDS-PAGE

Standards,

(SYPRO Orange)

Bio-Rad

broad range

4.5-200

200ul

6.5-200

Precision Plus

Protein

250, 150, 100, 75,

50, 37, 25, 20, 15, 0

24 applications

100 applications

Invitrogen

Mark12

Unstained STD

200, 116.3, 97.4,

66.3, 55.4, 36.5,

31.0, 21.4, 6.0, 3.5,

1ml（200 per

vial） ￥1537

Mini-gel 5ul/well

Standard-gel

2.5

10ul/well

Novagen

Perfect Protein

Markers

10-225

100 lanes $95

15-150

Broad Range

Promega

Protein MW

Markers

225, 150, 100, 75,

50, 35, 25, 15, 10(其

中50KD浓度是其它的

三倍)

100 lanes

ColorMeRanger

Pierce Bio.

Unstained

Protein MW

Marker Mix

3.5-200

48-96 doses

如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个

区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到

Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。

另外要记得，宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那

小的可能就已经跑掉了，不是质量不好哦。

这一系列的蛋白Marker一般相对贵点（由于制备蛋白比较繁琐）。相比而言NEB的这

一宽分子量的蛋白Marker不仅分子量范围大——从2/3到212kD，而且不贵——如果是小

胶，每次仅需4元左右，大胶将近9元（0.56ml包装）。而另一个美国公司MBI更是物真

价实，每个孔只需1元！（mini-gel）。另外除了价格方面，有些产品作的也十分有特色，

比如说Invitrogen公司的Mark12，这种蛋白Marker主要是用在Tris-Glycine 、Tricine或者

NuPAGE三种胶上，特色是可以分离分子量十分相近的蛋白，像是在30kD附近，它可以分

辨出31kD和37kD这样同在30kD级别分子量的蛋白，这对于有这一需要的实验室人员来

说是十分有帮助的。但是记住了Invitrogen的蛋白Mark使用时需要室温溶解，不能煮沸。

② 高分子量蛋白标准

厂家 产品名

Protein

Ladder(kD)

包装价格 用量

Bio-Rad

(Silver

Stain)

SDS-PAGE

Standards,

high range

45-200

200ul

Invitrogen

BenchMark

Protein

Ladder

220, 160, 120, 100,

90, 80, 70, 60, 50, 40,

30,25, 20, 15, 10

2×250ul

￥1271.9

Mini-gel 5ul

Full-sized gel 10ul

Silver

staining 0.2-0.5ul

HiMark

Unstained

Protein

Stadard

500, 290, 240, 160,

116, 97, 66, 55, 40

250ul ￥2305

Mini-gel(1.0mm)

5ul

(1.5mm) 7ul

Roche

Premixed

Protein MW

Marker

39.2-200

200ul

Mini-gel 5ul

Full-sized gel 10ul

GE

High MW

Range

14.3－220

250ul $142

AMRESCO*

High Range

Protein MW

Marker

212,116,97.4,66.2,40

100ul ￥187

500ul ￥892

建议6-8%胶，

点样量：5ul/well

观看英文在线讲座：二代测序的技术、应用、和数据分析概述

*AMRESCO是一家来自美国，提供生物分子学、生命科学、临床医学、组织学研究用高质量的

生化试剂的生产供应商。

检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准，这一类蛋白Marker价值也不菲，较便

宜的就是AMRESCO的（一次大约9元）和Invitrogen的BenchMark（一次mini胶大约13

块钱），而且后者还有15条蛋白带。而在应用上呢，各个厂家侧重点也不同，比较有特色

的是Invitrogen公司的HiMark（Invitrogen的蛋白标准命名十分贴切，比如前面的Mark12

就是指12条带的Mark，BenchMark就是基准的意思，这里的HiMark是High Mark的缩写），

HiMark这种蛋白标准可以说是真真正正的做到了高分子量——它最大的分子ladder可达到

500kD！这对于想要分辨200kD以上蛋白的顾客来说确实是个福音，当然这是有凝胶限制的，

合适凝胶的是NuPAGE Novex3-8% Tris-Acetate Gel 和NuPAGE Novex 7% Tris-Acetate

Gel(有一定的误差)，另外如果你想分离300kD和400kD的蛋白，HiMark也爱莫能助，因为

它的条带500kD以下就是290kD，无法正确分辨中间两个数量级的蛋白。

③ 低分子量蛋白标准

厂家

产品名

Protein

Ladder(kD)

包装价格

用量

Bio-Rad

Polypeptide

SDS-PAGE

Standards

1.4-26.6

1.4-97.4

200ul

MBI*

Protein

Molecular

Weight

Marker

116, 66.2, 45, 35,

25, 18.4, 14.4

2×1ml￥420

Mini-gel 5ul/well

Full length-gel 10ul/well

BBI*

Low Range

Protein

Marker

4.1, 6.5, 9.5,

14.4, 20, 27, 35,

45, 66

30ul ￥120

100ul ￥295

用Hoefer电泳系统，

8x12cm胶，可供30次上样

（100ul包装）。(建议使用

分离胶浓度15%)

AMRESCO

Mid/Low

Range

Protein

MW Marker

97.4，66.2, 40,

26.6, 21.5/19.7,

14.4

1ml ￥155

5ml ￥740

建议8-15%胶，

点样量：5ul/well

GE

Low MW

Range

16.949, 14.404,

10.7, 8.159,

6.214, 2.512

250ul $142

上海西巴斯

生物技术有

限公司

低分子量标准

蛋白

97, 66, 43, 31,

22, 14.4

冻干粉 ￥85

加入缓冲液配成200ul，每次

用10ul。

*MBI: Mathematical Biosciences Institute (The Ohio University)（/）

*BBI: 属于赛多利斯的集团子公司，赛多利斯公司是德国股票上市公司中最大的生物技术供应商

之一。

在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低蛋白标准分子量，除了有指示蛋白大小的作用以

外，有时还可以用作粗略的定量（说不定哪次实验就出现了预料不到的好结果，如果这时发

现没加上蛋白Marker，那可真是浪费了）。这样看来，好像低蛋白标准选购时价格高低就

代表了主要的筛选标准，其实更应该注重条带的清晰锐利与否，条带均匀与否——纯化不够

的Marker会成“团”而不利于判断大小，所以不能单纯以“价格”论英雄。

实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中，经常用到的，看上去也是最便宜就是

上海西巴斯生物技术开发有限公司的低分子量标准蛋白了，乍一听这个公司，恐怕很多人都

不知道是什么来的，这家公司其实就是中科院上海生物化学研究所旗下的一所独立核算单

位，其它自制试剂未见很有名，但它的低分子量标准蛋白和次高分子量标准蛋白在各个实验

室中传用的相当广泛。然而实际上，与主流产品不同，蛋白标准Marker，有些进口产品反

而要更便宜，比如说上表中MBI的Protein Molecular Weight Marker，仔细算下来，就算是

大胶，每次也只要大概2块钱，比上海西巴斯的4元一次便宜了一半，而且MBI的Marker

质量在业内口碑一向也不错，虽然如此，可能由于是到货时间长短和服务方便度的一些原因，

前者使用的仍然会比较多。除了MBI以外，目前正在打特价的Takara的Protein Molecular

Weight Marker也不错，208元可以用大约200次，详情请见特价专栏。

除了价格以外，在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋

白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外

提醒一句，特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量哦。

2. 预染蛋白分子量标准

预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在

电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实

验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳

情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，

如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到

最佳分辨效果；如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳；另外在

Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋

白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋

白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发

生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况

下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种

相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要

区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白

标准一起使用。预染Marker的条带大小也是厂家根据多种条件下实验数据给出

估算的结果——ABI的4色荧光测序可以精确到千位碱基的不也是“计算”出

来的吗？

预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，见下表（表中蛋白ladder

是根据一般实验结果得出的），其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带

的大小——Marker条带越多参考价值越大，可也就越难辨认区分，如果用不同

的颜色来区别就比较好辨认啦。再说了，那么沉闷的电泳实验中跑出五颜六色的

彩虹Marker，绚丽如同我们美丽的梦想，这时心情想必会愉快一些的哦，哈哈。

单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特

别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上

样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的

Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。

①

单色预染蛋白标准

①

厂家

产品名

Bio-Rad

Precision Plus

Protein All Blue

Standard

Prestained

SDS-PAGE

Standards,

broad range

High range

Low range

Invitrogen

BenchMark

Fluorescent

Protein Standard

SeeBlue(Plus2)

Prestained

Standard

4-250

(plus2 多两条带)

500ul ￥1537

Mini-gel:

10ul(electrophoresis)

3ul(blotting)

Standard-gel:

20ul(electrophoresis)

7ul(blotting)

NEB

Prestained 175, 83, 62, 48,

0.53ml/￥475

Mini-gel:

48-204

20-103

11-155

500ul

500ul

可用50次

可用50次

Standard 5-10ul

Protein

Ladder(kD)

250, 150, 100,

75, 50, 37, 25,

20, 15, 10

7.1-209

包装价格

500ul

用量

可用50次

500ul

可用50次

125ul ￥2764

Mini-gel 2-5ul

Protein Marker

33, 25, 17, 7

1.05ml/

￥1080

5.25ml /

￥4320

15ul(electrophoresis)

6ul(blotting)

Standard-gel:

30ul(electrophoresis

12ul(blotting)

48-96 gel lanes

Pierce

BlueRanger

Prestained

Protein MWM Mix

220, 1.4, 76,

45, 33, 26, 18

97.4, 66.2,

42.7, 31, 14.4

119, 19, 46, 31,

24, 19

BBI

Pre-stained

Protein Marker

25 Appli.

￥168

200ul ￥120

可供50次上样，

可供20次上样

Mini gel: 5ul/well

Large gel: 10ul/well

MBI

Prestained

Protein

Molecular

Weight Marker

2X0.25ml

￥420

在以上这些当中比较便宜的是NEB、BBI和MBI的蛋白标准了，其它

相对而言就比较贵了，像Pierce的BlueRanger Prestained Protein MWM

Mix每用一次光Marker就要大概人民币110元，真是令人咋舌，不过也是

物有所值：首先这种蛋白标准包装十分方便携带和使用，它是常温储存在48

孔板中，每次使用不需解冻，也不会降解，只要用枪头像将吸管插入刺穿外

层薄片，然后将枪头中的10ul去离子水注入Marker干粉中再吸起来就可

以了，这种独立包装也可以防止污染；其次这种蛋白Marker分子量范围较

广，从18.5kD到215kD（4-20%SDS-PAGE），而且难得的是在凝胶上

和转移膜上各条带分布水平和显色水平一致；还有就是这种Marker也可用

于染色（考马斯亮蓝染色和银染）。这各种高品质的表现，也难怪Pierce要

定位在这么高的价位了。

②

多色预染蛋白标准

报名参加2014 Bio-Rad NGC™ 新一代层析Worshop

厂家

产品名

Protein

Ladder(kD)

Invitrogen

BenchMark

Prestained

Protein Ladder

181.8, 115.5,

82.2, 64.2, 48.8,

37.1, 25.9, 19.4,

14.8, 6.0

2×250ul

￥1961

Mini-gel:

10ul(electrophoresis)

5ul(blotting)

Standard-gel:

20ul(electrophoresis)

10ul(blotting)

包装价格

用量

E-Page

SeeBlue

Prestained

Protein Ladder

500ul ￥1537

E-PAGE 96 gel:

10ul(electrophoresis)

5ul(blotting)

MultiMark

multicolored

Standard

3-250

500ul ￥1766

Mini-gel:

10ul(electrophoresis)

3ul(blotting)

Standard-gel:

20ul(electrophoresis)

7ul(blotting)

PE

Multicolored

Protein Marker

High range

29-205

Low range

6.5-45

Wide range

6.5-205

Pierce

GE

Trichrom

protein Marker

Rainbow

Molecular

Weight

Markers

High range

10-250

Low range

2.5-45

Wide range

14-220

Bio-Rad

Precision plus

protein Dual

Color Standard

Cambrex

FMC

ProSieve Color

Protein Marker

10, 15 ,20, 25,

40, 50,

80 ,125 ,190

100ul/529

500ul/1775

8-10ul/gel

10—250

16.5-210

500ul

48-96 mini-gel lanes

可用50次

能够出这一系列Marker的都是些实力雄厚的公司，比如Invitrogen，

比如PE。但其实，这种蛋白标准与上面的单色预染蛋白标准相差不大，就像

Pierce的TriChromRanger Marker与另一个产品BlueRanger基本就相

似，除了它的110kD条带是红色，而16.5kD条带是紫色。因此价格方面

这两种预染蛋白也不相上下，一般来说，Marker条带越多越有参考价值，当

然也会稍微贵一些，所以首选是有和自己目标条带最接近的Marker，如果没

有就找条带多的和比较均匀的，而且还要考虑每次上样的成本，不要光看价

格和包装大小了。各位读者就按自己的喜好购买吧。

3. Western专用的蛋白分子量标准

①生物素标记蛋白标准

未染色的Marker在做Western时，需要在印迹前先用丽春红或者是SYPRO

荧光蛋白染色液等不干扰Western Blot的染色方法显色，在胶上做标记最后才

能“拼”在最后的结果中，如果是预染的Marker就要在转膜后标记膜，或者剪

膜，最后在“拼上”。要是想直接将Marker结果显示在最后结果上，不用手工

作图或者拼接，那就要Western专用的Marker了。比如生物素标记的蛋白标

准。这种方法主要是配合化学发光法：在蛋白分子量上标记生物素，通过带有抗

生物素的抗体或者偶联链亲霉素的抗体，在化学发光检测到目的蛋白带时就可以

同时看到相应的分子量标准一起发光显影了。不同于普通蛋白分子量标准的便

宜、预染蛋白分子量的方便，这一方法的优点是与Marker和目的蛋白对应性好，

同时在同张片上显示，不用拼接，利于分析。缺点是如果样品中带有生物素背景，

那个抗生物素抗体有可能影响结果，而且反应体系太过复杂也会干扰实验结果。

厂家

Bio-Rad

产品名

Biotinylated

SDS-PAGE

Standards kit

(avidin-HRP

avidin-AP)

NEB

HRP Protein

Marker

Detection Pack

GE

Roche

ECL Western

Blotting MWM

Calibration

Proteins

biotin-labeled

上海康成

蛋白质检测试剂

盒

10—200

￥650

可以用50次

（mini-gel）

12.5-97

39.2-212

100ul

14.4—97

6.5-165

65 mini-blots $55

352 mini-blots $220

Protein Ladder(kD)

Broad range 6.5-200

High range 45-200

Low range 14.4-97.4

包装价格

250ul

用量

可用50次

可使用25次

生物素标记蛋白分子量产品其实并不多的，这里要提一下的就是上海康

成的蛋白质检测试剂盒。这个检测试剂盒是上海康成生物工程有限公司的拳头产

品。一般而言，常见的生物素标记都有一些缺点，比如说，要另外购买和制备试

剂啊，要摸索条件啊等等，而康成的这个试剂盒配合提供了所有需要的试剂，而

且用于免疫印迹化学发光检测的条件也已经得到优化，不用自己去摸索了，另外

此试剂盒的蛋白标准跨度较大——从10kD到200kD，这些都方便了使用者准

确的估计目的蛋白的大小。至于在价钱方面，这个试剂盒650元，可以用50

次（mini-blots），即一次13元，是在大部分实验室可以接受的水平。

②特殊标记蛋白标准

在经过修饰的蛋白标准中，除了生物素标记以外，近些年由于下游蛋白操作的丰

富化与复杂化，也出现带有“尾巴”的蛋白标准。比如His-Tag，如果每个Marker

条带都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗体很容易将Marker条带显示在

Western结果上。很方便，问题就是有可能有潜在的干扰，比如样品中正好有

类似Histag的结构。不过这可以通过对照检测的。

厂家

产品名

Protein

Ladder(kD

)

Invitroge

n

BenchMark

His-taggeded

Protein

Standard

160, 120,

80, 60,

50, 40,

30, 20,

15, 10

125ul ￥196

1

Mini-gel

5ul(electrophoresi

s)

2.5-5ul(blotting)

Standard

7ul(electrophoresi

s)

5-10ul(blotting)

Qiagen

Roche

6xHis Protein

Ladder

Multi-Tag-Mark

er

100, 75,

50, 30, 15

100, 75,

45, 30,

20, 10

Novagen

250ul

根据Tag的不同和抗

体的特异性不同，用量

也不一样（50-1000

次）

Perfect Protein 150, 100,

25, 15

25

lanes ￥713.

1

￥3208

50-100 lanes

N-terminal

RGS(H)6

GST-, HA-,

c-myc-,

His

6

-epitopes

*

S-/ His-

epitopes

His-tag

包装价格

用量

标记

Western Marker

50, 35,

*His

6

标记，1kD，可用anti-His抗体或Ni-NTA（Ni氨三乙酸配合物）conjugates检测

*HA(hemagglutinin 红血球凝集素)，大约1kD，可用anti-HA检测

*GST，26.5kD，可用anti-GST检测

*c-myc，可用anti-Myc检测

*S标记，S-protein FITC(

异硫氰酸

荧光素,Fluorescein isothiocynate) conjugate检测

咨询Bio-Rad，最新QX100 PCR系统技术资料>> >>

这些经过特殊标记的蛋白Marker一般都不会影响目的蛋白的正常显色，而且和

目的蛋白显色在同一张膜上，有时还可以作为阳性对照，但是各自的检测显色机

制和效果又有一些区别，比如Invitrogen的BenchMark和Qiagen的6xHis

Protein Ladder虽然都是用His作为标记，但是前者包含10条蛋白条带，可

以用Invitrogen自产的一种染料或者考马斯亮蓝染色，也可以用anti-His的抗

体进行色原显色或者化学发光进行检测，而后者强调的是精确的标定和阳性对照

的作用，而且Qiagen由于只出了这一种蛋白相关标准，对统一配置的要求没有

Invitrogen高，在说明书里也没有讲到要配合使用Qiagen的相关其它产品。

至于价钱方面，两家都是出了名的价格高，但相对而言这里Qiagen好像要便一

点。

另外值得一提的是Roche的Multi-Tag-Marker，其实不用讲，大家也知道这

种蛋白标准的优势：当然是它的全面性，这个全面性不仅仅是指

Multi-Tag-Marker包含GST-, HA-, c-myc-, His

6

-这四种最经常使用到的标

记，实验室购买后就可以用于多个标记蛋白的同时使用，而且，

Multi-Tag-Marker的全面性还表现在它除了可以用在Immunoblotting，还

可以用于Immunoprecipitation免疫共沉。是不是还是挺值得买的呢？