southern杂交标准步骤

一、试剂的选用和配置：

不同种类的尼龙膜其所采用的转移缓冲液和洗膜液不同。

本实验标准采用带正电荷的尼龙膜。

变性液/碱性转移缓冲液（应用于带正电荷尼龙膜的碱性转移）

0.4mol/L NaOH

1mol/L NaCl

配2×母液1L。

中和缓冲溶液Ⅱ（只用于碱性转移）

0.5mol/L Tris-Cl (pH 7.2)

1mol/L NaCl

20×SSC

800ml H

2

O溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，用几滴14mol/LHCl调pH至7.0，

用水定容至1L。分装后高压灭菌，试剂终浓度为3.0mol/L NaCl和0.3mol/L柠檬

酸钠。

10%(m/V) SDS

配制时68℃加热助溶，浓盐酸调pH至7．2，定容室温保存。（pH极易调过，

需小心！）

二、技术操作步骤：

Ⅰ、DNA酶切和低压电泳：

概述：酶切所需DNA的量为10μg～30μg，所需限制性内切酶量为10Unit酶/1μg

DNA，neb公司的限制性内切酶的最佳酶切条件为50μl体系酶切1～

2μgDNA。为了避免型号活性，注意所加酶的甘油含量和盐分含量（

glycerol

concentration > 5%, or pH > 8.0 may result in star activity

酶储液含50% glycerol，

因而酶最大用量不能超过酶切体系的10%），同时，选择内切酶时要注意其

可能因甲基化的敏感性导致基因组酶切效果不好。

1、400μl的酶切反应体系：（10～30μg）

30 μg DNA 酶300 U 37℃酶切16h。电泳检测酶切效果。1/10体积（40μl）3mol/L

醋酸钠2.5倍体积的冷无水乙醇（或0.6～1倍体积的遇冷异丙醇）-20℃沉淀

DNA，70%乙醇洗涤沉淀，溶解于25μl 1×TE。

2、荧光定量测定浓度后，加入5μl 6×上样缓冲溶液，56℃水浴5min，迅速置

于冰上2min，以破坏粘性末端可能形成的碱基对。1×TAE或0.5×TBE电泳缓

冲液和0.8%的琼脂糖凝胶以小于1V/cm的电压电泳12h。由于DNA在凝胶中会

扩散，因而最好不要将凝胶放置超过一天。（楼下电泳仪一般用30V）

3、修去凝胶边缘和加样孔上不平整的无用部分，加样孔端朝下，凝胶左下角

Marker侧，切去一小三角，作为凝胶方位的标记。

对于大于15kb的条带，可采用将凝胶置于0.2mol/L的HCl中数分钟，直到溴酚

蓝变黄，二甲苯青变成黄色/绿色后，迅速将HCl倒入废液缸，去离子水洗涤数

次。（强酸导致DNA脱嘌呤，而有利于转膜。但是，过度会导致DNA断裂成较

小片段。）

Ⅱ、DNA的变性、转膜装置组装和转膜：

1、带电荷的尼龙膜：

将凝胶浸入数倍体积的碱性转移缓冲溶液中，室温振荡15min。

更换一次碱性缓冲溶液继续浸泡20min。

2、切一张每边比凝胶大1mm的尼龙膜，并剪两张同样大小的厚吸水纸。（注意：

需带一次性PE手套和钝头镊子，沾有油污的膜不易浸湿。）

3、将膜飘浮于盛有去离子水的平皿中，直到其完全浸湿后，将其浸入适当的转

移缓冲溶液中至少5min，用干净的解剖刀切下膜的一角，与凝胶所切下的角

一致。（注意：膜的浸湿完全与否，对DNA的转移至关重要。浸湿的膜可保

存在高压的2×SSC饱和的3MM滤纸中，4℃保存。）

4、将一张厚的吸水纸放在一片树脂玻璃板或平皿上，形成比凝胶长且宽的支持

物。将支持物或皿放入一个大的干烤皿中，吸水纸两端从板边缘垂下。

5、干烤皿中加入适当的转移缓冲液，直到液面几乎与支持物表面平齐。当支持

物上的吸水纸完全浸湿后，用玻璃棒赶走吸水纸下的气泡。

6、将凝胶从变性液/碱性缓冲液中取出，倒转使原来的底面向上。放在支持物上，

并位于吸水纸中央。用玻璃棒赶走凝胶与吸水纸间的气泡。

7、用Parafilm膜包绕凝胶四周，不要覆盖凝胶。以屏蔽转移缓冲液从凝胶周围

短路流入吸水纸。

8、用适当的转移缓冲溶液将凝胶湿润。将湿润的尼龙膜放置于凝胶上并使两者

的切角相重叠。为避免产生气泡，当先使膜的一角与凝胶接触再缓慢的将膜

放到凝胶上。膜的一边应恰好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。膜一旦放在

凝胶上就不要再移动了。

9、在尼龙膜上放置两张与膜大小相同的吸水纸，切一叠略小于吸水纸的纸巾（5～

8cm高），将纸巾放在吸水纸之上，在纸巾顶部放一块玻璃板然后用一400g

重物压实。

10、转移8～24h，当纸巾湿润后更换新的纸巾。

11、除去凝胶上的纸巾和吸水纸，翻转凝胶以及与之接触的尼龙膜，凝胶向上平

放于干燥的吸水纸上。用极软的铅笔或圆珠笔标记加样孔的位置。

12、将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。

13、紫外成像检测凝胶上DNA的残留量，用以确定转移效率。

Ⅲ、DNA的固定：

带正电荷的尼龙膜的碱性转移：

碱性缓冲溶液会使DNA共价结合于带正电荷的尼龙膜上，因而不需要固定，

直接将膜浸入中和缓冲溶液Ⅱ，室温15min。浸泡以除去膜上的凝胶碎片，

同时使膜中和。

不带电荷的中性尼龙膜的中性转移：

1、将膜浸入6×SSC，室温放置5min，以除去粘附在膜上的凝胶碎片。

2、真空烘烤固定：将膜从6×SSC中取出，并使多余的液体流净。将膜放在纸

巾上室温晾干30min，将膜夹在两张干燥的吸水纸中间，真空炉中80℃烘烤

2h。

微波炉烘烤固定：将潮湿的膜放在一张干燥的吸水纸上，将微波炉调到最大

功率（750～900W）对膜加热2～3min。（直接进行杂交，或将膜干燥后吸水

纸中保存）

紫外照射交联：将潮湿的膜放在一张干燥的吸水纸上。254nm的紫外线照射

使DNA交联到膜上。（其原理是紫外线照射使DNA中的一小部分胸腺

嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团之间形成共价交联，但过量照射

将导致大部分的胸腺嘧啶共价结合而降低杂交信号。同时，紫外线照射

可能增强某些带正电荷的尼龙膜的杂交信号背景，因而应当使膜上带有

DNA的一面朝向紫外。建议对潮湿的膜采用总量1.5J/cm

2

，干燥的膜采

用0.15J/ cm

2

。）

3、对于不立即用于杂交的膜都应充分干燥，松弛的包于铝箔纸或吸水纸中，室

温下最好保存在真空条件。或待膜冷却后，用保鲜膜包好以后保存在-20℃备

用。

地高辛显色系统方案：

Ⅳ、探针的合成：（300bp~1kb）

一、PCR法标记探针：

概述：为了减少探针的非特异性扩增，最好不要以基因组DNA为模板直接合成

探针。需要对合成探针的片段进行PCR扩增并胶回收目的片段，回收后浓度

一般为20～40ng，可做为探针合成模板使用。

① PCR法合成探针

采用莱伯克生物科技公司的DIG DNA标记试剂盒Ⅰ，引物浓度为10pmol/μl，反

应体系为：

正向引物（50～100pmol） 5μl

反向引物（50～100pmol） 5μl

cDNA模板（10～20ng/μl） 1 μl

10× PCR缓冲溶液 2μl

MgCl

2

2μl

Dig-dUTP标记混合物Ⅰ 2μl

H

2

O Xμl

Taq DNA聚合酶 0.5μl

Total: 20μl

PCR反应程序：

94℃ 4min

94℃ 30s

60℃ 30s

72℃ 1min30s

72℃ 10min

4℃ ∞

紫外分光光度计测浓度后，保存在-20℃。（DNA探针杂交需5～25ng/ml，RNA

探针杂交需100ng/ml，寡核苷酸探针，0.1－10pmol/ml。CDP-star为底物时，探

针浓度应减少一半。）

经验量：取

5μl

电泳，条带清楚的话，每次杂交需

2

～

3μl

。

500ng/μl

的探针。

Ⅴ、杂交：

概述：标准杂交液的杂交温度在65～68℃，加有50%的formamide的杂交液或

High SDS Buffer的杂交温度为37~42℃。

1、探针变性：95℃煮沸5min（PCR仪中操作），立即置于冰上5min。

2、将膜放入杂交管中，DNA一面朝里，不能有气泡。

3、加入65℃预热的Hyb高效杂交液（美季）5ml（0.1ml/cm

2

），65℃ 8～15转

/min预杂交1h。

4、倒出预杂交液，另取适量预热的高效杂交液（5ml），加入变性的探针混匀（此

步可以用1ml的杂交液将探针稀释后再加）。加入杂交管中，65℃杂交过夜20h。

洗膜：

1、取出杂交管，倒弃杂交液至废液缸中，夹住露出瓶口的膜的一角将多余的杂

交液晾干。

2、将膜没入含有数百毫升的2×SSC及0.5%SDS的皿中，室温轻轻振荡5min。

切忌将膜干燥！

3、将第一次洗液倒入废液缸中，加入数百毫升2×SSC及0.1%SDS。室温下放

置15min，期间轻轻振荡数次。

4、将浸泡的溶液换成数百毫升新鲜的含有0.1%SDS的0.1×SSC。65℃下放置

30min～1h。并轻轻振荡。

5、室温下，0.1×SSC洗去膜上的泡沫。

显色：

概述：NBT（四唑硝基蓝）为碱性磷酸酶的最佳底物之一，在碱性磷酸酶催化下，

BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）被水解，BCIP脱磷并聚合而变蓝，过程中

放出的H

+

使NBT还原形成不溶性深蓝色的NBT-Formazan。

一般Dig1配置900ml后600ml用于配Dig3，100ml配Dig2（需加热溶解），

Dig5配200ml，Dig6显色配50ml。

1、Dig1 冲洗膜面 1/10体积的10×Dig1 Buffer

2、Dig2封闭1h 1% digoxin block reagent in Dig1 （需提前65℃加热溶

解）

3、Dig3 洗涤30min 1% BSA和0.3% Triton-X 100 in Dig1

4、Dig4 杂交2h 1:2000 anti-dig-AP in Dig3(现用现加)

5、Dig3 洗涤4次 每次10min

6、Dig1 冲洗并洗涤10min

7、Dig5 冲洗并洗涤10min 1/10体积的10×Dig5A和1%的六水和氯化镁 in

water

8、Dig6 锡箔纸包裹避光4℃显色过夜（切勿振荡）1/50体积NBT和1/50 BCIP

in Dig5（NBT和BCIP有毒，应戴手套操作。）

9、蒸馏水冲洗终止显色后保鲜膜包裹扫描。不要显色过头。

10、15～25℃干膜存放，其颜色会减淡，可在TE溶液中湿润。

生物素显色系统方案：

采用North2South® Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit探针标记试

剂盒。

Ⅰ、biotin标记探针按照说明书上操作。

Ⅱ、预杂交

① 将4℃取出的North2South® Hybridization Buffer放置至室温。

② 将膜放入杂交管中，加入杂交液0.1ml/cm

2

膜。

③ DNA在55℃下孵育至少30min。

Ⅲ、探针变性

① 100℃加热探针10min后，迅速放在冰上5min，变性探针。

Ⅳ、杂交

① 预杂交后，加入变性的生物素标记探针。（约30ng/ml杂交液）

② 55℃杂交过夜。

Ⅴ、严格洗膜

① 将North2South® Hybridization Stringency Wash Buffer(2×)37℃水浴溶解。

② 待Wash Buffer完全溶解后，加入等体积的ddH

2

O稀释为1×Buffer。（含有2

×SSC/0.1 SDS）

③ 0.2ml/cm

2

膜的1×Strigency Wash Buffer 55℃洗15～20min，共洗三次。

Ⅵ、亲和素杂交

注意用干净的镊子夹起膜的一角，不要夹其他部位，并用乙醇冲洗镊子。

① 到出Strigency Wash Buffer，加入足够的Blocking Buffer（至少0.25ml/cm

2

膜），

室温孵育15min～30min。

② 以1:300倍稀释的比例加入Streptavidin-HRP到杂交管的底部的Blocking

Buffer，注意不要与膜接触，摇动杂交管，待混匀后，室温孵育15min。

③ ddH

2

O稀释Wash Buffer（4×）为1×。洗膜4次，每次5min，室温。

④ 将膜转入干净的平皿中，加入Substrate Equilibration Buffer（0.25ml/cm

2

膜），

室温平衡5min。

Ⅶ、显影：

① 1:1体积混匀Lumind/Enhancer Solution和Stable Peroxide Solution，作为基质

反应液，其量能够满足覆盖到整张膜的表面。反应液现用现配，避光保存，

在室温下可稳定6h。

② 将保鲜膜平铺在桌面上，从平衡液中取出尼龙膜，在吸水纸上将多余的Buffer

控干。放在保鲜膜上。

③ 用1ml移液器将基质反应液均匀的涂在尼龙膜表面，用保鲜膜将尼龙膜包起，

注意不要让反应液流出。

④ 室温反应5min。

⑤ 将膜放入暗盒中，胶布将四角固定。

⑥ 在暗室中放入X光片，曝光10～20min。

⑦ 显影和固定。