混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.3

(22)申请日 2017.12.28

(71)申请人 南京理工大学

地址 210094 江苏省南京市孝陵卫200号

(72)发明人 金明杰 陈相雪 翟睿

(74)专利代理机构 南京理工大学专利中心

代理人 刘海霞

(51)

(10)申请公布号 CN 109971806 A

(43)申请公布日 2019.07.05

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

混合木质纤维素预处理方法及其发

酵工艺

(57)摘要

本发明公开了一种混合木质纤维素

预处理方法及其发酵工艺。所述的混合木

质纤维素预处理方法是以不同种类的木质

纤维素混合作为原料进行木质纤维素的预

处理，或木质纤维素经过预处理后，根据

浆液的酸碱性或抑制物浓度的高低，混合

酸性浆液和碱性浆液或混合低浓度抑制物

的浆液和高浓度抑制物的浆液。本发明利

用混合木质纤维素原料，结合不同木质纤

维素的优点，缓解由于木质素含量较高的

生物质导致的酚类抑制物浓度较高等问

题，同时和营养物质较为丰富的生物质进

行混合能够促进发酵过程，提高乙醇等发

酵产品产率，减少额外化学试剂的添加、

降低抑制物对发酵的不利影响。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,具体步骤如下:

步骤1,木质纤维素原料预处理:

将多种木质纤维素原料混合后,进行预处理后,得到木质纤维素浆液,或

将以单一木质纤维素或多种木质纤维素混合为原料,分别进行酸性预处理和碱性预

处理,再将预处理后的混合木质纤维素的酸性浆液和碱性浆液混合,或

先将一种木质纤维素原料进行酸性预处理或碱性预处理,依次分批加入不同种类的

木质纤维素,得到混合木质纤维素的预处理浆液,或

将单一木质纤维素或混合木质纤维素原料经过预处理得到抑制物浓度高和抑制物浓

度低的浆液,再将抑制物浓度高和抑制物浓度低的浆液进行混合;

步骤2,在预处理后得到的混合浆液中加入水解酶,进行水解;

步骤3,调节水解液的pH至发酵菌株的最适pH值,加入发酵菌株,发酵,得到发酵产

品。

2.根据权利要求1所述的混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,步

骤1中,所述的木质纤维选自小麦秸秆、玉米秸秆、农林废料、水稻秸秆、高粱秸

秆、大豆秸秆、林业废料、回收木浆纤维、木屑、软木,硬木以及动物粪便中的一

种或者多种。

3.根据权利要求1所述的混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,步

骤1中,所述的酸性预处理为稀酸预处理、热水预处理或蒸汽爆破预处理。

4.根据权利要求1所述的混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,步

骤1中,所述的碱性预处理为稀碱预处理、氨水预处理或氨气预处理。

5.根据权利要求1所述的混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,步

骤2中,所述的水解酶为纤维素酶,或纤维素酶和半纤维素酶的组合。

6.根据权利要求5所述的混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,所

述的纤维素酶为外切纤维素酶,内切纤维素酶或β-葡萄糖糖苷酶。

7.根据权利要求1所述的混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,步

骤3中,所述的发酵菌株为酵母、细菌或霉菌。

8.根据权利要求1所述的混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,其特征在于,步

骤3中,所述的发酵产品为丁醇,丙酮,乙酸,乳酸或脂肪烃目标产品。

说 明 书

技术领域

本发明属于生物质能源再生技术领域,具体涉及一种混合木质纤维素预处理方法及

其发酵工艺。

背景技术

木质纤维素作为可再生资源,可以有效缓解化石资源利用中带来的环境污染、能源

危机等问题。木质纤维素分布广泛,主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。由于

木质纤维素结构致密,通常需要经过预处理步骤打开结构,使木质纤维素更容易通过

酶解转化为可发酵糖,再进一步发酵生产乙醇等发酵产品。

然而,生物质的分布和产量受到季节、地域以及人们种植偏好等因素的影响。这些

因素会增加工厂在储存以及运输等方面的成本,阻碍纤维素乙醇等发酵产品大规模

工业化的生产。此外,生物质种类的多样和生长环境的差异会使得木质纤维素的结

构和成分有所不同,影响以木质纤维素为原料的乙醇等发酵产品生产工艺。不同类

型的生物质预处理后产生的抑制物种类和营养物质也不同。例如云杉比玉米秸秆的

木质素含量较高,因而可能在预处理后产生较多的酚类抑制物;甘蔗渣含有较多的营

养物质,更有利于后续的发酵过程。如果能够将不同种类的木质纤维素原料进行混

合,则在一定程度上可以结合各种木质纤维素结构和组成方面带来的好处,减少某种

木质纤维素由于结构或组成带来的负面影响,从而在整体上提高木质纤维素预处理

以及酶解发酵效果。

目前常用的预处理技术主要包括酸法预处理和碱法预处理。其中酸法预处理如稀酸

预处理

(Zhu,Z.,etal.,Comparativestudyofcornstoverpretreatedbydiluteacidandcellulosesolvent-

basedlignocellulosefractionation:Enzymatichydrolysis,supramolecularstructure,andsubstr

hnologyandbioengineering2009,103(4),715-24.)和热水预处理

(Kim,etal.,Improvementofsugaryieldsfromcornstoverusingsequentialhotwaterpretreatmen

ourcetechnology2016,216,706-13.)能够有效的去除半纤维素,增

加纤维素的可及性。碱法预处理如氨水预处理和稀碱预处理,能够去除部分木质素,

操作简单,但预处理过后的浆液中含有从生物质中脱除的木质素,如果不经过水洗,该

浆液可抑制酶解和发酵(Karp,etal.,AlkalinePretreatmentofCornStover:Bench-

tainableChemistry&Engineering2

014,2(6),1481-1491.)。此外,这两种预处理所产生的生物质浆料的pH过高或者过低,

因而需要外加大量的酸碱将pH调节至适合后续酶解发酵的范围,这将会增加额外的

后续处理成本。同时,对预处理浆料进行pH调节中会引入大量的盐,将会影响后续

的酶解和发酵制备乙醇等发酵产品过程。因此,如果能够将预处理浆料进行混合,则

能够有效克服的这两种预处理的缺点,从而提高乙醇等发酵产品的效率以及降低乙

醇等发酵产品的生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺。所述工艺利用

多种木质纤维素为原料,联合酸法和碱法预处理,对预处理浆料进行混合,无需脱毒以

及外加酸碱调节pH,减少工业生产成本,提高乙醇等发酵产品的产率。该

实现本发明的目的的技术方案如下:

混合木质纤维素预处理方法及其发酵工艺,具体步骤如下:

步骤1,木质纤维素原料预处理:

将多种木质纤维素原料混合后,进行预处理后,得到木质纤维素浆液,或

将以单一木质纤维素或多种木质纤维素混合为原料,分别进行酸性预处理和碱性预

处理,再将预处理后的混合木质纤维素的酸性浆液和碱性浆液混合,或

先将一种木质纤维素原料进行酸性预处理或碱性预处理,依次分批加入不同种类的

木质纤维素,得到混合木质纤维素的预处理浆液,或

将单一木质纤维素或混合木质纤维素原料经过预处理得到抑制物浓度高和抑制物浓

度低的浆液,再将抑制物浓度高和抑制物浓度低的浆液进行混合;

步骤2,在预处理后得到的混合浆液中加入水解酶,进行水解;

步骤3,调节水解液的pH至发酵菌株的最适pH值,加入发酵菌株,发酵,得到发酵产

品。

步骤1中,所述的木质纤维选自小麦秸秆、玉米秸秆、农林废料、水稻秸秆、高粱

秸秆、大豆秸秆、林业废料、回收木浆纤维、木屑、软木,硬木以及动物粪便等的

一种或者多种。

步骤1中,所述的酸性预处理指预处理后生物质浆液呈现酸性(pH<7)的预处理方法,

包括稀酸预处理、热水预处理和蒸汽爆破预处理等。

步骤1中,所述的碱性预处理是指预处理后生物质浆液呈现碱性(pH>7)的预处理方

法,包括稀碱预处理、氨水预处理和氨气预处理等。

步骤2中,所述的水解酶包含纤维素酶,根据预处理特性有时也包含半纤维素酶,所述

的纤维素酶选自外切纤维素酶,内切纤维素酶或β-葡萄糖糖苷酶等。

步骤3中,所述的发酵菌株选自酵母、细菌以及霉菌等。

步骤3中,所述的发酵产品可以是丁醇,丙酮,乙酸,乳酸,脂肪烃等目标产品。

与现有技术相比,本发明具有以下优点:

(1)以混合木质纤维素作为生产乙醇等发酵产品的原料,拓宽了木质纤维素乙醇等发

酵产品的原料范围,降低了企业经济风险。

(2)利用混合木质纤维素原料可结合不同木质纤维素的优点,缓解由于木质素含量较

高的生物质导致的酚类抑制物浓度较高等问题,此外,和营养物质较为丰富的生物质

进行混合可促进发酵过程,提高乙醇等发酵产品产率。

(3)节约化学试剂,降低工业生产成本,秸秆经过酸法或者碱法预处理后需要外加化学

试剂调节pH,可增加浆液中的盐浓度,影响微生物的发酵过程。本发明将酸性预处理

的木质纤维素和碱性预处理的木质纤维素进行混合,不需要外加化学试剂调节pH。

附图说明

图1为对比例1中稀碱预处理玉米发酵乙醇的浓度随时间的变化曲线图(a),(b)对比

例2中稀酸预处理玉米发酵乙醇的浓度随时间的变化曲线图。

图2(a)为实施例5和6中稀碱预处理玉米秸秆和稀酸预处理的玉米秸秆两种比例混

合后,酶水解糖的浓度随时间变化曲线图,(b)为实施例5和6中稀碱预处理玉米秸秆

和稀酸预处理的玉米秸秆两种比例混合后,72小时酶水解糖产率比较。

图3为实施例5稀碱预处理玉米秸秆和稀酸预处理的玉米秸秆按5:7.3比例混合后,

发酵乙醇的浓度随时间的变化曲线图。

图4为实施例6中稀碱预处理玉米秸秆和稀酸预处理的玉米秸秆按1:2.5比例混合

后,发酵乙醇的浓度随时间的变化曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

如表1所示,不同种类的木质纤维素的组成和营养成分不同,由于这种结构差异导致

预处理后生物质产生的抑制物种类和水解液成分也会有所差异。

表1生物质纤维素,半纤维素和木质素的成分

实施例1

将多种木质纤维素原料混合后,进行预处理后,得到木质纤维素浆液。

本实施例使用农作物生物质为原料进行乙醇发酵的工艺按以下步骤进行:

(1)生物质混合。将玉米、小麦和水稻秸秆进行混合,加入到反应器中,使底物质量浓

度为10%,添加氢氧化钠溶液(2%w/w),在121°C下预处理20min。使用盐酸调节pH

至6-7,将预处理的浆液置于烘箱中,于60°C下烘干水分至10-20%待用;

(2)混合生物质水解。将预处理后的浆液加入到反应器中,底物质量浓度为10%,调节

pH为4.7-4.9,加入Ctec2(北京诺维信公司)酶,在50°C的振荡箱(250rpm)内进行酶解

反应;

(3)乙醇发酵。将60ml的酶解液,加入到150ml的反应器中,调整pH至5.5-6.5,加入

酵母粉和蛋白胨,按初始OD

600

=1.0-2.0加入Zymomonasmobilis8b的细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

实施例2

将玉米、小麦和水稻秸秆进行混合加入反应釜中,添加稀硫酸溶液,使秸秆底物质量

浓度为10%,硫酸浓度为1%。在160°C下预处理10min,使用氢氧化钠调节pH至

6.0-7.0,然后将预处理后浆液置于烘箱中,于60°C下烘干水分至10%-20%。底物质

量浓度为10%,调节pH=4.6-7.0,加入Ctec2诺维信酶。酶水解后调至pH=5.5-6.5,加

入的酵母粉和蛋白胨,按初始OD

600

=1.0-2.0加入Zymomonasmobilis8b的细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

实施例3

先将一种木质纤维素原料进行酸性预处理或碱性预处理,依次分批加入不同种类的

木质纤维素,得到混合木质纤维素的预处理浆液。

本实施例是将结构致密的杨木加入反应釜中进行预处理,然后加入较易降解的玉米

秸秆。添加稀硫酸,使底物质量浓度为10%,在预处理最适反应条件下进行预处理。

之后使用盐酸/氢氧化钠将预处理浆液调节pH至6.0-7.0。将预处理后的混合浆液

置于烘箱中,于60°C下烘干水分至10-20%待用。底物质量浓度为10%,条件

pH=4.6-7.0,加入Ctec2诺维信酶进行酶解反应。酶水解后,将浆液调至pH=5.5-6.5,

加入酵母粉和蛋白胨,按初始OD

600

=2.0加入Zymomonasmobilis8b的细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

实施例4

将单一木质纤维素或混合木质纤维素原料经过预处理得到抑制物浓度高和抑制物浓

度低的浆液,再将抑制物浓度高和抑制物浓度低的浆液进行混合。

本实施例是将稀碱预处理的玉米秸秆和稀酸预处理玉米秸秆混合,混合比例5:7.3和

1:2.5。将混合浆液置于烘箱中,于60°C下烘干水分至10-20%待用。底物质量浓度

为10%,加入Ctec2诺维信酶进行酶解反应。酶水解后调至pH=5.5-6.5,加入的酵母

粉和蛋白胨,按初始OD

600

=1.0-2.0加入Zymomonasmobilis8b的细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

本实施例中混合后,抑制物浓度的前后变化对比,如表2和表3所示,稀碱预处理和稀

酸预处理玉米秸秆按5:7.3比例混合后浆液中的乙酸浓度为1.9g/L和总酚浓度

2.68g/L比稀碱预处理玉米秸秆浆液中乙酸和总酚含量要低,这样稀释了稀碱预处理

玉米秸秆浆液中抑制物的浓度,减少了对Zymomonasmobilis8b的抑制作用。

表2稀碱,稀酸和热水预处理后玉米秸秆浆液中的化学成分

注:NA表示浆液中抑制物浓度太低检测不出来。

表3混合秸秆浆液中的化学成分

注:1、碱-玉米秸秆代表稀碱预处理的玉米秸秆,酸-玉杆代表稀酸预处理的玉米秸秆;

2、NA表示浆液中抑制物浓度太低检测不出来。

实施例5

将以单一木质纤维素或多种木质纤维素混合为原料,分别进行酸性预处理和碱性预

处理,再将预处理后的混合木质纤维素的酸性浆液和碱性浆液混合。

本实施例将100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉米秸秆进行混合,

混合后pH=7。放置在60°C烘箱中,烘干至水分为10%-20%。底物质量浓度为10%。

加入Ctec2诺维信酶进行酶解反应。酶水解后调至pH=5.5-6.5,加入的酵母粉和蛋白

胨,按初始OD

600

=2.0加入Zymomonasmobilis8b的细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

本实施方式中稀碱预处理和稀酸预处理玉米秸秆按5:7.3比例混合如图2(a)所示,图

中

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉米秸秆混合葡萄糖酶水解的

曲线,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉米秸秆混合木糖酶水解的曲

线,从图2(b)条形图可以看出,100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉

米秸秆混合,72小时葡萄糖的产率87.72%(31.39g/L),木糖的产率94.98%(15.30g/L)。

图3为120小时发酵的曲线图,图中

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉米秸秆混合葡萄糖发酵的曲

线,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉米秸秆混合木糖发酵的曲线,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉米秸秆混合

Zymomonasmobilis8b细菌生长的曲线图,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和146g稀酸预处理的玉米秸秆混合乙醇浓度的曲线。

从图中可以看出,24小时酶水解液中葡萄糖基本消耗完,木糖在48小时后剩余

3.31g/L无法利用,120小时乙醇的浓度18.54g/L,Zymomonasmobilis8b细菌生长到

OD=5.4。

实施例6

将以单一木质纤维素或多种木质纤维素混合为原料,分别进行酸性预处理和碱性预

处理,再将预处理后的混合木质纤维素的酸性浆液和碱性浆液混合。

本实施例与实施例5不同的是使用将100g稀碱预处理的玉米秸秆和250g稀酸预处

理的玉米秸秆进行混合,混合后pH=4.6。放置在60°C烘箱中,烘干至水分为10%-

20%,使用混合秸秆底物质量浓度为10%,加入Ctec2诺维信酶进行酶解反应。酶水

解后调至pH=5.5-6.5,加入酵母粉和蛋白胨,按初始OD

600

=2.0加入Zymomonasmobilis8b的细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

本实施方式中稀碱预处理和稀酸预处理玉米秸秆按1:2.5比例混合如图2(a)所示,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和256g稀酸预处理的玉米秸秆混合葡萄糖酶水解的

曲线,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和256g稀酸预处理的玉米秸秆混合木糖酶水解的曲

线。从图2(b)条形图可以看出,100g稀碱预处理的玉米秸秆和256g稀酸预处理的玉

米混合,72小时葡萄糖的产率92.14%(33.38g/L),木糖的产率98.96%(16.30g/L)。图4

为120小时发酵的曲线图,图中

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和256g稀酸预处理的玉米秸秆混合葡萄糖发酵的曲

线,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和256g稀酸预处理的玉米秸秆混合木糖发酵的曲线,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和256g稀酸预处理的玉米秸秆混合

Zymomonasmobilis8b细菌生长的曲线,

为100g稀碱预处理的玉米秸秆和256g稀酸预处理的玉米秸秆混合乙醇浓度的曲线。

从图中可以看出,24小时酶水解液中葡萄糖基本消耗完,木糖在48小时后剩余

3.31g/L无法利用,120小时乙醇的浓度18.54g/L,Zymomonasmobilis8b细菌生长到

OD=5.4。

对比例1

(1)木质纤维素预处理。将玉米秸秆加入到反应器中,使底物质量浓度为10%,添加氢

氧化钠溶液(2%w/w),在121°C下预处理20min。使用盐酸调节pH至6-7,将预处理

玉米秸秆浆液置于烘箱中,于60°C下烘干水分至10-20%待用;

(2)混合生物质水解。将预处理后的浆液加入到反应器中,底物质量浓度为10%,调节

pH为4.7-4.9,加入Ctec2(北京诺维信公司)酶,在50°C的振荡箱(250rpm)内进行酶解

反应;

(3)乙醇发酵。将60ml的酶解液,加入到150ml的反应器中,调整pH至5.5-6.5,加入

酵母粉和蛋白胨,按初始OD

600

=1.0-2.0加入Zymomonasmobilis8b细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

对比例2

(1)木质纤维素预处理。将玉米秸秆加入到反应器中,使底物质量浓度为10%,添加硫

酸溶液1%,在160°C下预处理10min。使用氢氧化钠调节pH至6-7,将预处理玉米

秸秆浆液置于烘箱中,于60°C下烘干水分至10-20%待用;

(2)混合生物质水解。将预处理后的浆液加入到反应器中,底物质量浓度为10%,调节

pH为4.7-4.9,加入Ctec2(北京诺维信公司)酶,在50°C的振荡箱(250rpm)内进行酶解

反应;

(3)乙醇发酵。将60ml的酶解液,加入到150ml的反应器中,调整pH至5.5-6.5,加入

酵母粉和蛋白胨,按初始OD

600

=1.0-2.0加入Zymomonasmobilis8b细菌,在30°C的振荡箱(150rpm)内进行发酵。

两个对比例中稀碱预处理玉米秸秆乙醇的发酵如图1(a)和(b)为120小时发酵的曲线

图,图中

为玉米秸秆经过预处理葡萄糖发酵的曲线,

为玉米秸秆经过预处理木糖发酵的曲线

为玉米秸秆经过预处理乙醇浓度的曲线,

为玉米秸秆经过预处理Zymomonasmobilis8b细菌生长的曲线。从图中可以看出,稀

碱预处理的玉米秸秆乙醇的产率比较低,浓度只有0.50g/L,且Zymomonasmobilis8b

细菌基本不生长。这个是由于稀碱预处理中的酚类化合物和乙酸含量较高,抑制

Zymomonasmobilis8b细菌生长(如表1所示)。而稀酸预处理的玉米秸秆乙醇的浓度

为18.21g/L,葡萄糖基本被利用完,Zymomonasmobilis8b细菌OD

600

值为4.8。