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2024年3月26日发(作者：可想之数组词)

细胞pulldown实验的详细步骤及详细说明

利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通

过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相

互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

GST-pulldown主要包括以下三个部分：①利用基因重组技术构建带有GST标签的

原核表达载体；②通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；③利用GST亲和纯

化柱进行蛋白纯化获得高纯度的融合蛋白，再利用GST亲和纯化柱进行蛋白间的相互作

用检测。

细胞蛋白裂解液，洗脱液：

PBS及PBS+1%Triton-100

PBS （1L）

NaCl： 8g

KCl： 0.2g

Na2HPO4： 1.44g

KH2PO4： 0.24g

加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即

可，高温高压灭菌,4℃保存备用。

PMSF（苯甲基磺酰氟） MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存

浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可。保持于-20℃或者4℃。

（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）

1、原核融合蛋白A的获得

（1）将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21（DE3）菌株

（2）挑取单个克隆到含有5mlLB（+100ug/mlAmp）的10ml试管里，37℃培养

过夜

（3）将培养菌液转移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L锥形瓶中，

37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培

养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细

菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N

（4）室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液

（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀

（5）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉

（6）11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清， -80℃保存备用


本文标签： 蛋白 融合 原核 利用 表达

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