不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析

热带作物学报2021, 42(10): 30083016

Chinese Journal of Tropical Crops

不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析

霍玉鑫

1

，甘番露

1

，王玉晶

1

，张雪妍

1

，王旭初

1,2*

，谢全亮

1,2*

1. 海南师范大学生命科学学院/热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南海口 571158；2. 石河子大学生命科学学院和农学

院，新疆石河子 832003

摘 要：酚抽法已经逐渐成为植物蛋白质组研究中通用的蛋白质提取方法，但在各种改进酚抽法中，应用到的沉淀试

剂各不相同，致使蛋白沉淀得率、纯度和沉淀时间也各异，本研究以热带植物橡胶树叶片、胶乳和海马齿叶片为研究

材料，在过饱和硫酸铵甲醇溶液、醋酸氨甲醇溶液和丙酮溶液沉淀剂下对比蛋白提取的效果，通过单向电泳检测、胶

图质量分析、质谱鉴定、蛋白沉淀时间和得率比较，发现3种沉淀剂提取的蛋白样品1-DE图谱显示的蛋白条带数量均

较多，但醋酸铵沉淀法提取蛋白图谱有条纹不清晰现象。得出结论：丙酮沉淀法对橡胶树叶片和胶乳蛋白质的提取率

较高，硫酸铵沉淀法对海马齿叶片蛋白质提取率较高。过饱和硫酸铵甲醇溶液和丙酮沉淀剂提取的蛋白质质量较高，

所得蛋白图谱背景清晰，质谱鉴定蛋白质信息量大。研究结果可优化提取高质量植物蛋白质的方法，并有望为顽拗类

植物蛋白质组学研究提供参考。

关键词：蛋白提取；橡胶树；海马齿；沉淀剂；聚丙烯凝胶电泳；质谱

中图分类号：TQ936 文献标识码：A

Comparative Analysis of the Effects of Different Precipitation Agents

on Extraction of Plant Protein by Phenol Extract

1. Hainan Normal University / Key Laboratory of Tropical Island Ecology, Ministry of Education, College of Life Sciences, Haikou,

Hainan 571158, China; 2. College of Life Science and Agricultural, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832003, China

All Rights Reserved.

HUO Yuxin

1

, GAN Panlu

1

, WANG Yujing

1

, ZHANG Xueyan

1

, WANG Xuchu

1,2*

, XIE Quanliang

1,2*

Abstract: The borax/PVPP/phenol (BPP) protocol is a widespread protein extraction method in plant proteome research.

However, BPP extraction of plant protein, combined with different precipitation agents, the precipitation time, yield and

purity of extracted protein is strikingly different. In this study, Sesuvium portulacastrum and Para-rubber tree leaves,

and rubber latex were used as the research materials. The plant protein was extracted and analyzed with precipitating

agents of supersaturated potassium ammonium sulfate alcohol solution, ammonium acetate methanol solution and ace-

tone solution. Using the methods of SDS-PAGE, gel electrophoresis image quality, mass spectrum identification, settling

duration and comparative analysis of protein yield, it was showed that the protein bands extracted by the ammonium

acetate precipitation method were not evident. Hevea leaves and latex showed a higher yield of protein in acetone solution.

S. portulacastrum leaves had a higher yield of protein in supersaturated potassium ammonium sulfate alcohol solution. The

clear background of gel electrophoresis figures was found for the supersaturated potassium ammonium sulfate ethanol so-

lution and acetone solution. The comprehensive protein sequence information identified by mass spectrometry had a higher

quality of precipitated protein. The research results can optimize the method of extracting high-quality plant protein, and it

will be expected to provide references for recalcitrant plant taxa proteomics research in the future.

Keywords: protein extraction; Hevea brasiliensis; Sesuvium portulacastrum; precipitant; polypropylene gel electropho-

resis; mass spectrometry

DOI: 10.3969/.1000-2561.2021.10.035

收稿日期 2020-12-15；修回日期 2021-03-08

基金项目 国家自然科学基金项目（No. 32060072，No. 31860224）；中国博士后科学基金面上项目（No. 2021M693872）。

作者简介 霍玉鑫（1999—），女，本科生，研究方向：生物技术。*通信作者（Corresponding author）：王旭初（WANG Xuchu），

E-mail：******************.cn；谢全亮（XIE Quanliang），E-mail：************************.cn。

第10期 霍玉鑫等: 不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析 3009

从植物组织中制备高质量的蛋白质样品用于

蛋白质组学分析是一个巨大的挑战，而蛋白质组

学已经发展成为研究植物蛋白功能的重要技术手

段

[1-2]

，是一种检测植物基因在转录后是否被翻译

和修饰等较新颖且有效的研究植物蛋白的方法，

从而填补了从转录组到代谢组的中间空缺

[3-5]

。目

前，蛋白组学的研究技术方法有很多，例如2-DE

[6]

、

MALDI

[7]

、Label-free

[8]

和iTRAQ/TMT

[9]

等技术，

被广泛用于研究某种特定生理环境下动植物的全

蛋白、差异表达水平以及互作分析等。但由于植

物各种组织细胞中含有特定的物质能够降低提取

蛋白的质量及产率，所以无法提取固定得率的蛋

白质，需要针对特定的材料采取特定的提取处理

方法

[10-11]

，从而提高提取植物蛋白质的质量，这

也是决定蛋白质组学后续比较分析的关键因素。

由于植物组织的特殊特性，通常因坚固的细

胞壁、蛋白酶、大的液泡、高浓度的有机酸和次

级代谢产物（酚类化合物和色素）等物质，严重

干扰蛋白质的提取、分离和鉴定，致使从植物各

组织中分离蛋白质组分具有很大的挑战性，也是

影响植物蛋白组学研究最关键因素

[12-14]

。利用酚

抽法可用于顽拗类植物组织中蛋白质提取

[15]

，但

提取蛋白的得率还需进一步提升。针对木本植物

橡树、松树和杨树的次生木质部总蛋白提取，发

现使用优化的TCA-丙酮方法，提取蛋白质效果最

佳

[16]

。在挪威针云杉和欧洲山毛榉的叶和根中分

离蛋白质，发现在包含7 mol/L尿素和2 mol/L硫

脲的分离液剂下提取和分离蛋白质最佳

[17]

，但提

取方法中并未涉及沉淀剂的深入讨论。在谷物种

子中用不同缓冲液可以分离出种子内不同蛋白质

用于蛋白质组学研究

[18]

，其在沉淀剂选择上并未

改进。以三氯乙酸、丙酮沉淀和苯酚提取黄连木的

雄性和雌性植物蛋白质比较研究，详细描述了这3

种提取方法的优缺点和应用，使研究者能为特定的

物种、组织或细胞类型选择合适的方法

[19]

，但是

在沉淀剂的选择方面也未深入研究。在模式植物

拟南芥中提取总蛋白时，可用常规溶解剂就能溶

解一系列蛋白质，并实现其高效定量的回收，使

用这种方法可用于试剂盒直接定量

[20]

，但并非绿

色植物都可以使用该方法。随后，Flengsrud

[21]

在

大麦叶、马铃薯叶和云杉针叶组织中提取蛋白质，

克服了绿色植物中固有的蛋白质组学分析障碍，

但在蛋白质的产率和纯化方面还有待优化。综上

所述，在植物蛋白提取方法不断更新过程中，蛋

白得率和质量是影响蛋白组学深入研究的主要因

素，针对这方面的困难应着眼于在提取不同植物

组织蛋白质过程中，如何选取最佳沉淀剂，从而

获得纯度较高的蛋白质。

在笔者前期的研究中，发现利用本实验室改

进酚抽法（Borax/PVPP/Phenol，BPP）提取橡胶

树以及海马齿组织蛋白的得率以及质谱鉴定结果

相差都非常大，难以进行后续蛋白质组学分析研

究。因此，为了克服上述困难，我们选择了巴西

橡胶树（Hevea brasiliensis）的叶片和胶乳（含多

糖多酚类物质）以及高含盐海岸植物海马齿

（Sesuvium portulacastrum L.）的叶片材料特殊

性，提供了一种辅助蛋白质提取方法，首次针对

这3种材料在BPP提取缓冲液结合过饱和硫酸铵

甲醇溶液、醋酸铵溶液和丙酮溶液3种沉淀剂展

开了蛋白提取方法的研究，在蛋白得率、凝胶图

谱和质谱鉴定等方面系统分析。通过实验表明，

针对不同植物材料选择不同沉淀剂的方法，确实

对植物蛋白质提取很有效，并且同时适用于聚丙

烯凝胶电泳及质谱分析的2种蛋白组学分析手

段。为采用BPP法提取不同植物蛋白时选择合适

的沉淀剂提供理论支持，也为今后植物蛋白质组

学研究提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以中国热带农业科学院实验田内橡胶树（‘热

研73-3-97’）新鲜叶片（Hevea leaves，HL）、

橡胶树新鲜胶乳（latex，LA）以及番杏科多年生

匍匐草本植物海马齿新鲜叶片（Sesuvium leaves，

SL）为实验材料。橡胶树切割先让胶乳流25滴

以上，流尽树皮表面的杂质后开始取样，取样用

的割刀需要高温灼烧消毒灭菌后使用，以免引起

H. brasiliensis死皮病。用植物蛋白质BPP法

（Borax/PVPP/Phenol）提取蛋白。BPP蛋白提取

缓冲液配置：100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris,

50 mmol/L维生素C，50 mmol/L硼砂，1%（V/V）

Triton X-100，1 g（W/V）PVPP，30%（W/V）蔗

糖和2%（V/V）β-巯基乙醇，pH 8.0；蛋白裂解

液：1%（V/V）IPG buffer，2 mol/L硫脲，2%（W/V）

CHAPS，7 mol/L尿素，13 mmol/L DTT；标准

Laemmli buffer：0.001%（W/V）溴酚蓝，2%（W/V）

SDS，5%（V/V）β-巯基乙醇，10%甘油，62.5 mmol/L

Tris-HCl；胶条平衡液：0.002%（W/V）溴酚蓝，

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3010

热带作物学报

第42卷

2%（W/V）SDS，30%（V/V）甘油，50 mmol/L

Tris-HCl，6 mol/L尿素；GAP凝胶染色液：0.125%

（W/V）考马斯亮蓝G-250，5%（V/V）磷酸，10%

（W/V）硫酸铵，10%（V/V）甲醇，30%（V/V）

乙醇；凝胶脱色液：5%（V/V）乙酸，30%（V/V）

乙醇；胰蛋白酶缓冲液；25 mmol/L碳酸氢铵，

1 mmol/L氯化钙，pH 8.5。

1.2 方法

1.2.1 植物蛋白的提取 采集植物组织后，立即

浸入液氮预冷研钵中速冻，并加入1% PVPP粉末

防止氧化，充分研磨成干粉后，称取3 g植物组

织粉末，加入盛有10 mL预冷BPP提取缓冲液

50 mL离心管中，室温涡旋震荡10 min。加入等

体积Tris饱和酚，室温涡旋震荡10 min。用BPP

提取缓冲液配平，4 ℃，16 000 ×g，离心15 min。

吸取上清液于新的50 mL离心管中，再次加入等

体积BPP提取缓冲液，4 ℃涡旋震荡5 min。再次

加入BPP提取缓冲液配平，4 ℃，16 000 ×g，离

心15 min。取上清液1 mL，分装入含有5 mL不

同沉淀剂的10 mL离心管中，不同沉淀剂为：（1）

预冷的过饱和硫酸铵甲醇溶液（supersaturated

ammonium sulfate methanol，SAM）可使蛋白质溶

解性变小产生物理沉淀，称为蛋白质“盐析”现

象。（2）丙酮溶液（acetone solution, AS）通过

有机溶剂丙酮溶液破坏蛋白质的水化层，降低介

电常数，从而增强带电蛋白质分子之间的相互作

用，促进蛋白颗粒聚集沉淀。为避免蛋白变性，

丙酮溶液需要低温且操作时间尽量缩短；（3）预

冷0.1 mm/L的乙酸铵溶液（ammonium acetate

solution，AA）中性盐减少蛋白质变性，但可破

坏蛋白质的水化膜，暴露出憎水区域，使蛋白质

聚集沉淀，憎水区的多少决定沉淀量。沉淀剂均为

上清液体积的5倍即：蛋白提取上清液/沉淀剂=

1/5，置于‒20 ℃过夜沉淀。

1.2.2 蛋白定量 采用Bradford方法蛋白定量，

Bradford定量液：0.05 g CBB G-250，95%乙醇

25 mL，50 mL 85%磷酸，超纯水定容至500 mL，

滤纸过滤使用。在测定样品浓度前，先制作标准

蛋白的标准曲线。样品要置于冰上保持低温，准

备牛血清标准蛋白（bull serum albumin，BSA）

作为标准样品，裂解液lysis buffer（LB），紫外

分光度仪器设定测样品蛋白OD

595

，测定每个样

品至少重复3次。

1.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳染色和图像采集 使

用不连续胶聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

法根据分子量大小对蛋白质进行分离。分离胶浓

度为12.5%，浓缩胶浓度为5%。25 μL蛋白质样

品上样体积：20 μL（V样品+VLB）+5 μL蛋白

loading buffer，marker：10 μL，蛋白质量约为

30 μg，与Laemmli buffer混匀后上样。电泳在

16 ℃恒温水浴下进行，电泳程序设定：10 W、

40 min，20 W、1.2 h。

凝胶染色：考马斯亮蓝G-250染色液按照标

准化配方提前一天配制。漂洗后的凝胶转入染色

液中，摇床低速30 r/min染色过夜。

脱色：脱色液标准化配方现用现配。取出染

色好的凝胶放入蒸馏水漂洗5 min，转入脱色液

中，按照标准化试剂配方中的方法进行脱色过程。

凝胶分析：脱色后的凝胶用ImageScanner Ⅲ

扫描仪（GE Healthcare）进行扫描和图像采集扫

描凝胶，扫描时保证图片分辨率，并保存。利用

ImageMaster 5.0软件分析蛋白电泳图谱条带数。

1.2.4 凝胶胶内蛋白酶解 选取目标差异蛋白，

进行胶内酶解，胰蛋白酶液与含有蛋白的凝胶粒

混合后，在37 ℃恒温水浴，酶解15 h。酶解后收

集酶解上清液直接用于质谱鉴定。

1.2.5 质谱鉴定及蛋白数据库搜索 将上述酶解

产物进行质谱鉴定，采用的是布鲁克公司基质辅

助激光解析电离飞行时间质谱仪（5800 MALDI-

TOF Bruker），进行一级和二级质谱分析。所获

得的蛋白数据通过Mascot Distiller软件分析肽的

指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）得

出结果，再利用Matrix Science网站（www.

）进行蛋白肽段匹配和数据库搜

索鉴定。

2 结果与分析

2.1 橡胶树叶片、胶乳和海马齿叶片的总蛋白

提取

酚抽法是植物蛋白提取的常用方法，而BPP法

是本实验室在此法的基础上进一步优化改良的一

种高效蛋白提取方法，既适于从多糖多酚类及高盐

分含量的植物材料的蛋白质提取，还可用于顽拗植

物获得较高产量蛋白。利用BPP法可在橡胶树新鲜

叶片、新鲜胶乳和海马齿新鲜叶片中提取到

3~10 mg/g不等的总蛋白，针对这3种材料，我们

设计3种蛋白质沉淀剂，蛋白质提取过程（图1）。

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第10期 霍玉鑫等: 不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析 3011

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A：橡胶树新鲜叶片；B：橡胶树胶乳；C：海马齿新鲜叶片。

A: Fresh leaves of H. brasiliensis; B: Fresh latex of H. brasiliensis; C: Fresh leaves of S. portulacastrum

图1 基于不同沉淀剂的蛋白提取示意图

Fig. 1 Schematic diagram of protein extraction based on different precipitants

在不同沉淀剂下提取总蛋白得率结果显示，

每克材料的蛋白得率偏差比较大，其中HL在不

同沉淀剂下的得率大小顺序为：AS-HL（10.64±

0.06 mg/g）> SAM-HL（5.10±0.06 mg/g）>AA-HL

（3.09±0.01 mg/g）；LA的总蛋白得率在不同沉淀

剂下的大小顺序为：AS-LA（5.35±0.02 mg/g）>

AA-LA（4.43±0.02 mg/g）>SAM-LA（3.386±

0.08 mg/g）；SL总蛋白得率大小顺序为：SAM-SL

（6.385±0.06 mg/g）>AA-SL（5.371±0.04 mg/g）>

AS-SL（1.959±0.04 mg/g）。比较结果显示，HL

总蛋白得率在AS得率最高；LA在AS沉淀时总

蛋白得率最高，SL在SAM沉淀剂下蛋白得率最

高（图2）。

图2 不同沉淀剂下蛋白得率

Fig. 2 Determination of protein yields from

H. brasiliensis and S. portulacastrum

2.2 聚丙烯酰氨凝胶电泳分析

从SDS-PAGE的结果可以看出，经过除杂后

的蛋白条带边界轮廓清晰，凝胶图背景干净，分

离效果好，并未出现条带拖尾和弥散不均的现象

（图3）。

在高分子量（>100 kDa）区域和较低分子量

（<20 kDa）区域均可监测到明显的蛋白条带。应

用ImageMaster 5.0软件对1-DE图谱进行蛋白的

条带统计分析，不同沉淀剂下的结果检测出不同

数目的蛋白条带（表1）。经过统计蛋白条带结果

显示，SAM沉淀剂下的平均条带较多（39±1.41），

3012

热带作物学报

第42卷

A：醋酸铵溶液沉淀剂下的1-DE电泳图谱；B：过饱和硫酸铵钾醇溶液沉淀剂下的1-DE电泳图谱；

C：丙酮溶液沉淀剂下的1-DE电泳图谱。

A: 1-DE image of Ammonium acetate solution precipitant; B: 1-DE image of Supersaturated ammonium

sulfate methanol solution precipitant; C: 1-DE image of Acetone solution precipitant.

图3 橡胶树的叶片、胶乳和海马齿叶片蛋白1-DE图谱

Fig. 3 1-DE images of total proteins extracted from leaf of Hevea leaves, latex and Sesuvium leaves results

表1 聚丙烯酰氨凝胶电泳蛋白条带统计

Tab. 1 Statistics of protein bands by polyacrylamide gel electrophoresis

样品

Samples

条带数

Number of protein bands

样品

Samples

条带数

Number of protein bands

样品

Samples

条带数

Number of protein bands

SAM-HL 41±1.41 SAM-LA 35±0.63 SAM-SL 42±1.41

AA-HL 29±2.45 AA-LA 28±2.42 AA-SL 31±1.50

AS-HL 37±3.90 AS-LA 34±2.45 AS-SL 38±3.44

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其次，AS沉淀剂下的平均蛋白条带（36±1.41），

蛋白条带最少的是AA的1-DE平均蛋白条带较少

（29±2.42）。而且橡胶树叶片和海马齿叶片组织

的蛋白条带具有相似的图谱，在条带数和个别条

带在丰度上出现一定的差异。

2.3 蛋白胶内酶解及MALDI TOF质谱分析

挖取凝胶上各选取12个重复性好、分离性

好、相对丰度较高且是已知具有代表性蛋白进行

胶内酶解，其中包括二磷酸核酮糖羧化 （ribulose

bisphosphate carboxylase，RubisCO）、小橡胶粒子

（small rubber particle protein，SRPP）和橡胶延

伸因子（rubber elongation factor，REF），利用本

实验室改进后报道的蛋白酶解方法进行胶内酶

解，随后进行MALDI TOF 5800质谱仪进行一级

质谱和二级质谱鉴定，经鉴定获得了较好的PFF

和PMF质谱图谱（图4）。鉴定到的蛋白数据进

行数据搜库，由于热带植物海马齿还未发表基因

组及转录组数据专有的蛋白数据库，因此将质谱

鉴定结果通过Mascot Distiller软件分析，随后用

Matrix Science在NCBInr中的（NCBI-National

center for biotechnology information non-redundant

database）绿色植物蛋白总库，利用在线引擎

（/ search）进行搜索，

经一级和二级质谱鉴定特定标记性蛋白，共鉴定

了36个蛋白质，从所得的PMF一级质谱图谱上

看，主要肽段质谱离子峰集中范围在800~

2500 m/s之间，这说明在这个酶切片段更加有利

于下一步二级质谱分析。并说明提取蛋白中含杂

质少，无其他蛋白污染。这些特定蛋白的总肽段

数在10~62左右，最高可达到62条（表2），并

且Trypsin的自切峰强度较低，该方法中酶切充

分，不易自切。由于热带典型海岸植物海马齿没

有发表基因组及对应的蛋白数据库，因此，质谱

鉴定结果通过Mascot Distiller分析，鉴定后统计

了蛋白理论等电点和分子量，蛋白实验等电点和

分子量，匹配肽段的数量，覆盖率和得分等情况。

利用Matrix Science 搜索引擎对鉴定的蛋白

及肽段搜库匹配，36个蛋白点相关信息，统计可

信蛋白理论等电点和蛋白分子量与实验测定的蛋

白等电点和蛋白分子量进行统计比较，结果显示

第10期 霍玉鑫等: 不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析 3013

图4 代表性蛋白点肽指纹图谱

Fig. 4 PMF profile of representative protein spot

实验测定值和理论值基本一致，有小部分蛋白的

实验等电点与分子量和理论值有偏差，例如

All Rights Reserved.

A4-1，鉴定结果发现蛋白的分子量有偏差，经理

论分析这些蛋白可能是某些蛋白的亚基结构，在

生物学功能的蛋白组成中，通常都是由多个亚基

组合而成，这些蛋白主要参与翻译后修饰无机离

子和氨基酸转运代谢，分子伴侣和信号转导等代

谢通路的作用产生了蛋白结构变化。通过变性凝

胶电泳将蛋白亚基结构分离，因此，鉴定蛋白的

实验等电点和分子量会出现一定范围内的偏移现

象。根据蛋白搜库结果显示，HL和SL在SAM

沉淀剂下肽段匹配数和覆盖率质量高于AA和AS

沉淀剂的质量；LA蛋白提取在AA沉淀剂下的蛋

白质量优于SAM和AS沉淀剂提取的蛋白质量。

3 讨论

几十年来，已在许多植物物种中进行了大量

的蛋白质组学研究，但是植物蛋白质提取的质量

高低仍然是影响蛋白质组学研究最重要因素

[19]

。

聚丙烯凝胶电泳一直是一种最广泛用于分离

总蛋白的工具提取物以及从各种途径获得的蛋白

质级分预分馏程序

[12]

。为了获得高质量高纯度的

植物蛋白质，我们基于BPP缓冲液结合3种沉淀

剂，提取了橡胶树和海马齿等组织的蛋白质，相

比较两者的蛋白得率和质量差异较大，但是蛋白

质图谱与前期橡胶树和海马齿蛋白图谱非常不

同。与前期研究中的凝胶图谱相比

[22-24]

，我们的

凝胶图谱更清晰，并且包含更多的蛋白条带。在

鉴定代表性蛋白质中，相同蛋白质包含不同的蛋

白质同工型，在凝胶图谱上也具有不同的实验Mr

和pI值，分析原因可能是由于修饰蛋白质变形后

所致。

在过去的植物蛋白提取方法的研究中，针对

提取缓冲液的改进优化研究较多，例如在植物叶

片

[13, 15-17, 20, 25-26]

、种子

[18, 21, 27]

、根

[28]

以及花器

官

[12, 19]

等，但是着眼于研究植物蛋白提取过程中

沉淀剂的选择方面涉及内容较少。我们比较3种

沉淀剂的蛋白得率和质谱鉴定结果发现，HL和

SL在SAM沉淀剂提取蛋白质量优于其他2种沉

淀剂；LA的蛋白提取在AA的蛋白质量优于其它

两个沉淀剂提取的蛋白质质量。而通过硫酸铵和

醋酸铵比例的优化，可以限制蛋白变性并能提高

蛋白质提取的质量

[22]

，这一结果与前人研究结果

保持一致，但该方法并未在高盐生植物蛋白提取

中应用。聚丙烯酰胺凝胶电泳可比较3种沉淀剂

提取蛋白质的质量

[29-30]

，虽然3种沉淀剂的蛋白

质图谱在较高和较低的Mr区域均可观察到了明

显的蛋白条带，且大部分相似，但是标记性蛋白

3014

热带作物学报

表2 部分高丰度的蛋白质质谱鉴定结果

Tab. 2 List of sectional proteins with relatively high abundance identified by MALDI-TOF/TOF-MS

第42卷

编号

a

蛋白名称

b

登陆号

c

Number Protein name Accession number

等电点/分子量（实验值/理论值）

d

匹配肽段数/覆盖率

e

pI/M

w

(experimental/theoretical Matching peptide num-

value) ber/coverage rate/%

6.09/53.0; 6.32/50.2

6.09/53.0; 6.49/48.9

6.09/53.0; 6.06/52.1

4.80/22.0; 4.71/25.0

4.80/22.0; 4.88/24.0

4.80/22.0; 4.65/23.0

5.04/15.0; 4.95/12.0

5.04/15.0; 5.08/15.0

5.04/15.0; 5.02/13.0

6/22; 28%

6/47; 29%

6/48; 28%

13/62; 21%

14/37; 38%

13/62; 21%

10/33; 30%

10/33; 30%

10/33; 30%

分数

f

Score

390

225

463

94

161

94

125

126

125

A1-1 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

A1-2 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

A1-3 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

A2-1 Small rubber particle protein

A2-2 Small rubber particle protein

A2-3 Small rubber particle protein

A3-1 Rubber elongation factor

A3-2 Rubber elongation factor

A3-3 Rubber elongation factor

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653602.1

ref|XP_021653602.1

ref|XP_021653602.1

A4-1 Ribulose bisphosphate carboxylase AAA84059.1 6.26/53.8; 6.69/55.5 4/12; 33% 366

A4-2 Ribulose bisphosphate carboxylase ADG02945.1 6.26/52.9; 6.89/56.3 3/9; 27% 277

A4-3 Ribulose bisphosphate carboxylase AAA84059.1 6.26/53.8; 6.64/60.2 3/9; 33% 264

B1-1 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

B1-2 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

B1-3 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

B2-1 Small rubber particle protein

B2-2 Small rubber particle protein

B2-3 Small rubber particle protein

B3-1 Rubber elongation factor

B3-3 Rubber elongation factor

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653602.1

ref|XP_021653602.1

ref|XP_021653602.1

6.09/53.0; 6.45/53.1

6.09/53.0; 6.05/52.9

6.09/53.0; 6.08/53.0

4.8/22.3; 4.61/12.8

4.8/22.3; 4.61/12.8

4.8/22.3; 4.33/20.6

5.04/15.0; 5.28/19.6

5.04/15.0; 5.21/25.3

5.04/15.0; 4.8/22.3

6.70/53.2; 6.75/55.2

6.12/52.1; 6.89/39.7

6.09/53.0; 6.16/53.2

6.09/53.0; 6.42/51.5

6.09/53.0; 6.01/53.0

4.8/22.3; 4.58/21.5

4.8/22.3; 4.8/22.3

4.8/22.3; 4.64/22.3

5.04/15.0; 5.28/19.6

5.04/15.0; 5.04/14.7

5.04/15.0; 5.04/14.7

10/10; 26%

6/24; 25%

8/48; 28%

4/12; 61%

5/12; 55%

8/57; 58%

12/21; 34%

3/18; 31%

5/14; 38%

9/21; 26%

3/13; 23%

7/19; 26%

6/23; 26%

6/24; 25%

10/21; 74%

10/21; 74%

5/35; 71%

5/27; 41%

5/14; 46%

5/14; 46%

542

497

809

455

410

558

494

483

319

663

127

481

484

441

887

739

830

519

451

433

B3-2 Rubber elongation factor

All Rights Reserved.

B4-1 Ribulose bisphosphate carboxylase AFY17050.1

B4-3 Ribulose bisphosphate carboxylase CAA04981.1

C1-1 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1|

C1-2 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

C1-3 Ribulose bisphosphate carboxylase ref|YP_004327670.1

C2-1 Small rubber particle protein

C2-2 Small rubber particle protein

C2-3 Small rubber particle protein

C3-1 Rubber elongation factor

C3-2 Rubber elongation factor

C3-3 Rubber elongation factor

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653597.1

ref|XP_021653602.1

ref|XP_021653602.1

ref|XP_021653602.1

B4-2 Ribulose bisphosphate carboxylase ADD12830.1 6.16/52.6; 3.52/57.5 6/25; 26% 781

C4-1 Ribulose bisphosphate carboxylase AAA84059.1 6.26/53.0; 6.03/50.6 7/42; 24% 374

C4-2 Ribulose bisphosphate carboxylase ADG02945.1 6.26/53.0; 6.06/52.1 6/25; 17% 250

C4-3 Ribulose bisphosphate carboxylase AAA84059.1 6.26/53.0; 6.06/52.1 6/48; 17% 388

注：

a

为1-DE上的蛋白点；

b

为鉴定出来的蛋白名称；

c

为NCBI nr数据库中的登录号；

d

为鉴定出来的理论（T.）和实验（E.）

的分子量（kDa）及等电点；SC是鉴定出的蛋白覆盖的氨基酸序列的百分比；

f

代表数据库中PMF和PFF的数据搜索分数。

Note:

a

Assigned spot as indicated on 1-DE;

b

The name of proteins identified by MALDI TOF MS;

c

Database accession numbers ac-

cording to NCBInr;

d

Theroetical (T.） and experimental (E.） mass (kDa) and pI of identified proteins;

e

Number of the matched peptides

(MP) with PMF and FPP and the total searched peptides (TP);

f

Mascot searched scores against the database NCBInr for PMF and PFF.

条带的清晰度和灰度有明显的差异。李肖芳等

[31]

利用3种方法对盐生植物盐角草的蛋白提取，其

中丙酮沉淀和三氯乙酸沉淀提取的蛋白杂质较

多，在蛋白凝胶图中有严重拖尾或横向纹理现象。

第10期 霍玉鑫等: 不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析 3015

而本研究的凝胶图谱结果可见更清晰的蛋白条

带，说明选取合适的蛋白沉淀剂可以获得更高纯

度的蛋白质。从总体上看，BPP方法可以收集到

低浓度的蛋白质，并且获得的蛋白质可以成功用

于蛋白质组学分析。本研究结果也说明，BPP方

法结合不同沉淀剂可获得更多多糖多酚植物和高

盐盐生植物高质量的蛋白质，保证能够提取低浓

度溶液中的蛋白质。迄今为止，这3种沉淀剂之

间蛋白得率及提取蛋白质量进行比较研究还尚未

报道，本研究是首次提出BPP方法结合不同沉淀

剂进行蛋白提取分析的研究。

综上所述，BPP方法结合3种沉淀剂的使用，

具有被广泛应用的潜力，还可用于低蛋白浓度溶

液的植物蛋白质组学分析。学者可根据研究材料

选择最适沉淀剂提取蛋白，这对于不同植物提取

高纯度和高质量的蛋白质极其重要，也为植物蛋

白组学获取高质量蛋白提供一定的理论基础。

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责任编辑：崔丽虹

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