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2024年12月29日发(作者：listing什么意思)
Abstract
Tobacco etch virus protease (TEVp) is widely utilized for cleavage the fusion tags
owing to its stringent sequence specificity. Previously, we constructed the TEVp
5M
codon
variant with increased yield but decreased specific activity. To further improve protein
folding and increase the protein expression level of the TEVp,
we combined different
approaches to obtain new TEV protease with high yield and activity
.
Cleavage of different
fusions absorbed with the corresponding resin using the constructed fusion protein.
The
results are as follows:
variants were constructed. Based on the TEVp
5M
codon variant, we created
three variants with mutations of K45F, E106G and K45F/E106G.
sion level and activity of TEVp variants were investigated. Qualitative
analysis of TEVp variants in soluble were determined by SDS-PAGE and quantitative
analysis of TEVp variants in soluble showed that as comparison to the TEVp
5M
codon
variant, soluble yield of E106G variant in E. coli BL21(DE3) was increased by 28% ,
contrary to that of other two variants K45F and K45F/E106G by GFP fluorescence
ative and quantitative analysis of the purified fusion protein
H6GST-tevS-eDAL as a TEVp substrate showed that activity of E106G variant on cleaving
the designed protein substrate was raised by 32%. Other two variants including K45F and
K45F/E106G were less active than the TEVp
5M
codon variant.
TEVpE105G fusion proteins were constructed. We chose four protein tags
including GroEL, GroES, DnaK and MBP to fuse with the E106G variant at N-terminus
respectively. The TEVp recognition sequences is placed at the fusion junction of the fused
tag and target protein. InfB(1–21) sequence is directly attached to the TEVp
5M
E106G
variant.
sion level and activity of TEVp mutant in fusion protein were assessed.
DnaK and MBP effectively enhanced soluble production of the TEVp construct and InfB
(1–21) sequence decreased solubility of the protein than the His6-tag in E. Coli BL21(DE3)
but GroEL and MBP significantly increased the activity of TEVp mutant.
ing rare tRNAs on function of the fusion tag was E. coli strain
Rosetta
TM
(DE3), InfB(1–21) sequence and MBP effectively enhanced soluble production
of the TEVp. InfB(1–21) sequence and GroEL increased highest cleavage activity of TEVp
mutant.
III
6. Effect of the TEVp recognition sequences on fusion protein was analyzed.
The tevS
in the fusion protein MBP-tevS-TEVp-H6 was deleted to generate the fusion
MBP-TEVp-H6.
We found that deletion of the tevS did not affect soluble expression levels
in two in E. coli strains correspondingly but significantly enhanced the activity in the
Rosetta
TM
(DE3).
protein with different fusion tag were purified respectively. We analyzed
purification and specific activity of different TEVp constructs and determined efficiency of
on-resin cleavage of the five fusion proteins.
In conclusion, we confirmed that
further amino acid mutations in improving protease
soluble were influenced by other mutations. Certain fusion tags on improving protein
production and quality is dependent with rare tRNAs abundance. In E. coli strain
Rosetta
TM
(DE3),
We first identified that GroES faintly increased protein solubility of the
current research shows that the strain selection is important for optimization of
the fusion tags. Even with assistance of the fusion tag, desirable production and quality of
TEVp construct are not combined in the purified TEVp constructed fusion
protein of TEVp mutant for on-resin cleavage of partial fusion proteins made certain target
proteins purified in single step.
Key words: Tobacco etch virus protease，mutation，fusion tags，activity，Escherichia coli
IV
目录
摘要 ................................................................................................................................ I
Abstract ........................................................................................................................ III
目录 .............................................................................................................................. V
1 文献综述 ................................................................................................................... 1
1.1 蛋白重组及融合标签的应用 .......................................................................... 1
1.2 TEV蛋白酶及其突变体研究 .......................................................................... 2
1.3 大肠杆菌中tRNA丰度对表达外源蛋白影响的研究................................... 3
1.4 融合蛋白的亲和柱上酶切研究 ...................................................................... 4
2 引 言 ......................................................................................................................... 5
2.1 研究目的和意义 .............................................................................................. 5
2.2 研究内容 .......................................................................................................... 5
3 材料与方法 ............................................................................................................... 6
3.1 材料 .................................................................................................................. 6
3.1.1 菌株和质粒 ........................................................................................... 6
3.1.2 试剂 ....................................................................................................... 6
3.1.3 仪器和设备 ........................................................................................... 6
3.1.4 部分缓冲液的配制 ............................................................................... 6
3.1.5 本研究中所需要的引物 ....................................................................... 7
3.2 方法 .................................................................................................................. 8
3.2.1 载体构建的相关反应体系 ................................................................... 8
3.2.2 构建烟草蚀斑病毒蛋白酶突变体K45F、E106G和K45F/E106G .. 9
3.2.3 构建带不同标签的E106G融合表达载体 .......................................... 9
3.2.4 用于柱上酶切5种融合蛋白底物表达载体的构建 ......................... 11
3.2.5 不同TEVp突变体的表达分析 ......................................................... 11
3.2.6 GFP荧光强度检测不同TEVp突变体水溶性表达 .......................... 12
3.2.7 不同TEVp突变体的活性分析 ......................................................... 12
3.2.8 带不同标签的E106G融合蛋白的表达及活性分析 ........................ 13
3.2.9 融合蛋白的诱导表达纯化及产量测定 ............................................. 13
3.2.10 纯化的TEVp活性分析 ................................................................... 14
3.2.11 MBP-E106G-H6用于融合蛋白的亲和柱上酶切效率分析 ............ 14
4 结果与分析 ............................................................................................................. 15
4.1 载体构建 ........................................................................................................ 15
V
4.2 定性定量分析不同TEVp突变体的表达 .................................................... 16
4.3 定性定量分析不同TEVp突变体的活性 .................................................... 17
4.4 分析不同标签对E106G蛋白酶表达及活性影响 ....................................... 17
4.5 分析提高胞内稀有tRNA水平对标签效应的影响..................................... 18
4.6 分析融合蛋白中TEVp识别序列的作用 .................................................... 19
4.7 带不同标签的E106G产量和活性的分析 ................................................... 20
4.8 MBP-E106G-H6作为工具酶用于融合蛋白的亲和柱上酶切效率分析 ..... 21
4.8.1 H6GST-tevS-mPrx融合蛋白的亲和柱上酶切................................... 22
4.8.2 H6GST-tevS-sDAL融合蛋白的亲和柱上酶切.................................. 22
4.8.3 MBP-tevS-eDAL融合蛋白的亲和柱上酶切 ..................................... 23
4.8.4 H6GST-tevS-mSrx融合蛋白的亲和柱上酶切................................... 24
4.8.5 GST-tevS-mSR融合蛋白的亲和柱上酶切 ........................................ 25
5 讨论 ......................................................................................................................... 27
5.1 不同TEVp突变体水溶性及活性研究 ........................................................ 27
5.2 不同标签对TEVp表达及活性影响研究 .................................................... 27
5.3 TEV蛋白酶作为工具酶用于融合蛋白亲和柱上酶切研究 ........................ 28
结论 ............................................................................................................................. 30
参考文献 ..................................................................................................................... 31
致 谢 ..................................................................................................................... 39
个人简介 ..................................................................................................................... 40
VI
1 文献综述
1.1 蛋白重组及融合标签的应用
目前，蛋白重组技术是蛋白质结构和功能研究的重要方法，将目的基因克隆到
表达载体并在宿主细胞中生产重组蛋白质
[1-7]
。大肠杆菌由于其遗传背景清楚，在普
通培养基上能快速生长，易于操作且繁殖周期短，外源基因表达水平高，代谢和调
控机制比较清晰，是目前表达外源蛋白质最为简单廉价的方法，于是，大肠杆菌表
达系统常被用来表达重组蛋白质
[8-15]
。然而，该系统也存在着一些缺陷，如缺乏真
核细胞蛋白质翻译后修饰系统，不能有效地表达过长或过短的外源蛋白质，缺少一些
真核细胞常用的tRNA，内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白，重组蛋白在
大肠杆菌中过度表达常常以不溶性无功能的包涵体的形式存在
[16-21]
。因此，人们采
取多种改进措施来提高重组蛋白质在大肠杆菌中的水溶性表达及折叠，如改善诱导
条件
[22]
、融合标签表达
[23-27]
、与分子伴侣共表达或融合表达
[28-29]
、降低细胞生长温
度
[30-31]
、定位表达
[32-34]
、添加促折叠剂和选择宿主细胞等来改善外源重组蛋白的产
量及折叠性。
其中融合标签技术是基因重组技术的一种，其原理是利用重组DNA技术在编码
靶蛋白基因的C端或N端融合某种标签的基因，选择适宜的宿主细胞来表达重组蛋
白质
[31]
，且表达的重组蛋白质可以通过融合的标签进行纯化。常用的融合标签有多种，
如麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)
[35-36]
、谷胱甘肽S-转移酶
(glutathione S-transferase，GST)
[37-39]
、纤维素结合蛋白(cellulose-binding protein，
CBP)
[40-41]
、硫氧还蛋白(thioredoxin A，TrxA)
[42-43]
、六聚组氨酸(His6-tag)
[44-45]
、小
泛素修饰物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)
[46-48]
等。这些融合标签可以提高
重组蛋白质的产量，使得蛋白水溶性显著提高，而且还可以促进蛋白折叠，从而改善
一些蛋白酶的活性并且部分标签还可用于蛋白纯化，为得到高产量、高活性、高纯度
的目的蛋白提供便利
[49-50]
。已有研究报到大肠杆菌中编码翻译起始因子II的基因
InfB(1-21)序列作为表达标签(expressivity tag，Ex-tag)，可以通过改变mRNA折叠来
提高重组蛋白的产量
[51]
。也有研究发现特定的大肠杆菌分子伴侣DnaK、GroEL与蛋
白融合表达可以提高目的蛋白的水溶性
[52]
。但是，研究表明这些在N端或C端的融
合标签可能会影响目的蛋白的结构而破坏它天然的功能，影响蛋白结晶，或赋予其新
的功能，因此在蛋白质结构和功能研究中，常常需要将融合标签从靶蛋白上移除
[53-56]
。
目前，去除融合标签的方法有四种，即化学方法、内切蛋白酶法、外切蛋白酶法
及内含肽的自我切除法
[54]
。虽然化学法相对于蛋白酶法，具有效率高、耗时短、成本
低廉等优点，同时此方法也存在着很大不足，如所需反应条件可能破坏蛋白结构，导
1
致靶蛋白失活，尤其是对药用蛋白的处理；化学切割时容易产生副反应，试剂中的一
些基团可能与氨基酸侧链结合而改变目标蛋白的特异性；这些缺点制约了化学法在去
除标签时的广泛应用
[55-57]
。与化学法相比，内含肽的自我剪切法反应条件温和，不会
使靶蛋白损伤致不可逆失活，简化了纯化的过程，同时，节约了大量的时间和成本，
但该方法也存在其不足之处，自我剪切后会给目的蛋白带上多余的氨基酸残基，反应
条件不易控制、自我剪切的诱导剂可能影响蛋白质的二硫键及相关结构的形成
[58-59]
。
与化学法和自我剪切法相比，酶学法反应条件更加温和，特异性较高和不产生毒副作
用等优点而被广泛应用
[60-61]
。目前，常见的蛋白酶如人鼻病毒3C蛋白酶(Human
rhinovirus 3C protease，R3P)
[56,62-64]
、SUMO水解酶Ulp1
[56]
、羧肽酶
A/B(Carboxypeptidase A/B)
[65-66]
、氨基肽酶M(Aminopeptidase M)
[67]
、Xa因子(Factor
Xa)
[68-69]
、凝血酶(Thrombin)
[70]
、肠激酶(Enterokinase)
[71]
和烟草蚀斑病毒蛋白酶
(Tobacco etch virus protease，TEVp)
[72-74]
。TEVp由于其识别序列高度专一性以及其
催化反应条件的广泛性而得到人们越来越多的重视
[75-78]
。
1.2 TEV蛋白酶及其突变体研究
烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease ，TEVp)是烟草蚀斑病毒核包体
a(Nuclear Inclusion a)蛋白中大小为27kDa的催化区域
[79]
。TEVp具有很强的位点特
异性，其特异性识别序列E-Xaa-Xaa-Y-Xaa- Q-G/S
[80]
，其中ENLYFQG为最常识别序
列，其切割位点在最后两个氨基酸之间，在靶蛋白的N端只留下一个氨基酸残基。
同时该酶反应条件广泛，反应PH 在5.5-8.5和反应温度在4-30℃的范围都有催化活
性，因此在选择反应条件时，可根据其催化融合蛋白底物的情况而定。因此，TEVp
通常被用于体内、体外切割标签和目的蛋白之间的TEVp识别序列，从而使目的蛋白
释放出来
[81-85]
，TEVp除了用于移除融合标签外，还可用于监测蛋白质之间的相互作
用、检测蛋白的结构和功能、用于原核细胞核糖体开关的监测及生化反应的体外检测
[86-89]
,因此TEVp在蛋白质研究中被广泛应用。
野生型TEVp在表但是野生型TEVp在大肠杆菌表达和纯化存在一定的缺陷
[90]
，
达时，在其自身的特定位点上会发生分子内自剪切，从而使得该蛋白酶的活性和稳定
性大大降低，而且在大肠杆菌表达时，大部分都以包涵体的形式存在，产量和水溶性
都很低。为了提高该蛋白酶的水溶性，科学家们在野生型TEVp上将219位的丝氨酸
(Ser)突变为缬氨酸(Val)或天冬酰胺(Asp)后发现该蛋白酶稳定性和活性都有很大的
改善
[91]
。但S219N的产量和野生型的TEVp类似，其可溶性依然比较低，大部分蛋
白酶还是以包涵体的形式存在于沉淀中
[91]
。也有报道在野生型TEVp的基础上进行
K45F或E106G突变可以促进该蛋白酶的折叠
[109]
。Lei Fang等人将TEVp和大肠杆菌
分子伴侣在低温诱导条件下共表达，使TEVp产量提高到了65mg/L，而且酶活性得
2
到一定的保留
[92]
。等人将一新型Sreptag II标签融合到TEVp的N端从而提
高了其水溶性，并在18个月的研究中表明其稳定性也得以维持
[93]
。Blommel，P.G等
人尝试将MBP与TEVp融合表达时发现，融合蛋白酶表达量得到了明显的提高
[94]
。
吴旭东等人将超折叠的绿色荧光蛋白(sfGFP)与TEVp融合表达也提高了其表达量
[95]
。科学家们通过对野生型突变体筛选，得到一个双突变体(L56V/S135G)，不仅提
高了TEVp的水溶性，而且提高了TEVp的耐热性
[96]
。与突变体融合报告基因，筛选
出三突变体(T17S/N68D/I77V)，其产量比野生型蛋白酶提高了五倍之多
[97]
。Lingling
Wei等人在突变体S219V上同时进行了五个位点(T17S/L56V/N68D/I77V/S135G)的
突变，从而构建了整合型五突变体。并与野生型、二突变及三突变的TEVp进行了比
较，该蛋白的水溶性，表达量和活性都得到很大程度的提高
[ 72]
。Jie Fang等人进一步
研究了这几种TEVp突变体之间的功能稳定性差异，在不同温度反应条件下整合型五
突变体的热稳定性最好，而在不同浓度变性剂条件下反应时五突变体的稳定性不高，
二突变体及野生型突变体的变性剂耐受性高于五突变体和三突变体；在不同大肠杆菌
表达环境下，二突变体也显示较高的稳定性，因此在一些含有较高变性剂存在的缓冲
液中适合使用TEVp
2M[73]
。Kapust R B在2002年通过分析密码子偏爱性后而对TEVp
中六个稀有的精氨酸密码子进行同义突变，发现其表达量较野生型的有很大的上升
[74]
。Jie Fang等人在整合型TEVp
5M
的基础上构建了15个同义密码子突变体，对其活
。
性及水溶性进行了分析比较，密码子同义突变对蛋白酶的水溶性和折叠性都有影响
[75]
1.3 大肠杆菌中tRNA丰度对表达外源蛋白影响的研究
融合蛋白在大肠杆菌中高效表达不但与密码子偏爱性有关，而且还与mRNA的
稳定性、mRNA的折叠、翻译的效率及蛋白自身特性有关
[99]
。大肠杆菌中密码子
CGA,CUA，AUA,CCC和AGG/AGA相对应的tRNA含量高低决定着其合成外源蛋
白质的产量和质量
[100]
。在细胞中 tRNA 的含量不同，有的含量多，而有的含量则较
少，并且同义密码子在翻译时对应使用的tRNA种类也不同，因此核糖体翻译时，含
量高的tRNA所对应的密码子则能较快速地与正确的tRNA相匹配，因而提高了外源
蛋白合成的速度及蛋白折叠，这些和高含量 tRNA 相匹配的密码子就是最优密码子。
随着外源基因表达水平的升高，所受的对翻译效率的选择压力就越大，因此密码子的
偏好性也就越高,而当表达水平较低时，其相对应的密码子偏好性也相对较低。因此
现在通常把基因的密码子偏好程度作为该基因的表达水平的标志
[101]
。然而，对翻译
效率的选择压力，并不是造成生物体密码子偏好性的全部原因，外源基因的表示水平
也不完全与其基因的密码子偏好程度相关, 已有研究表明，低偏好性的基因也可以有
较高的表达水平
[102]
。如果目的基因的密码子与表达宿主不匹配，则会降低mRNA的
3
翻译效率和稳定性，甚至会造成翻译的提前终止或氨基酸残基的错误插入，从而影响
蛋白质的合成
[103]
。
基于以上问题，为了提高大肠杆菌中外源基因的表达，通常通过提高宿主细胞中
稀有tRNA丰度或改造目的基因的密码子，两者都能起到很好的效果。大肠杆菌
Rosetta
TM
(DE3)菌株含有表达六个稀有密码子对应的tRNA的pRARE质粒，因此增
加亮氨酸的密码子CUA，精氨酸稀有密码子AGG和AGA，异亮氨酸的密码子AUA，
脯氨酸的密码子CCC和甘氨酸的密码子GGA所对应的tRNA丰度，于是,很适于表
达含大肠杆菌稀有密码子基因的外源蛋白,尤其是在该系统中的表达真核细胞蛋白
[104]
。稀有tRNA含量主要通过影响核糖体翻译的效率和精度来影响合成肽链的折叠，
从而影响了蛋白质二级结构的形成，因此在生物体长期进化过程中，tRNA被认为是
一种重要的基因表达调控手段
[105]
。在蛋白质合成过程当中，tRNA作为一重要因素参
与其中，它的种类和含量在一定程度上直接或间接地影响了外源基因表达的速率和折
叠。2009年科学家们在研究中发现人为增加大肠杆菌某些低丰度的tRNA量在提高
外源蛋白表达水平的同时伴随着可溶性蛋白量的降低
[106]
。Jie Fang等人也证明了提高
稀有tRNA的丰度，提高外源融合蛋白的表达，但相比于BL21(DE3)表达而言更容
易提高包涵体蛋白的产量，外源基因编码的蛋白质自身的溶解性和折叠型往往决定着
该基因在大肠杆菌中的表达水平
[75]
。
1.4 融合蛋白的亲和柱上酶切研究
融合蛋白亲和柱上酶切原理：在标签与靶蛋白之间加入蛋白酶的识别序列，蛋白
酶也应带有同靶蛋白相同标签，被切下的靶蛋白的另一端则不含有此标签，因此把融
合蛋白底物和蛋白酶可同时固定在相对应标签可结合的树脂上，当柱上酶切后，用洗
柱液洗脱时，靶蛋白就随洗柱液一起而被分离出来，而此时标签、蛋白酶、未完全切
开的融合蛋白底物则结合在树脂上，从而一步纯化就得到纯度较高的目的蛋白。人们
通常将融合蛋白底物纯化后，进行液相切除融合标签，多数情况下还得利用亲和色谱
进行分离目的蛋白，标签，未被完全切开的融合蛋白底物及蛋白酶，液相酶切法步骤
繁琐、反应时间长且获得目的蛋白的效率低，此方法不易应用于大规模获得目的蛋白，
为了解决此问题，已有人研究了融合蛋白的亲和柱上酶切。刘海峰等人利用亲和柱上
酶切法将两种融合表达的药物蛋白进行柱上酶切后纯化，得到纯度较高的目的蛋白并
且不影响药物蛋白的功能，同时其柱上酶切效率均高于液相酶切
[107]
。科学家们将一
新型Sreptag II标签融合到TEVp的N端，将纯化的该融合蛋白固定在亲和柱上，作
为工具酶用于切除融合标签，并且该固定化酶在18个月内酶切活性都得到保持
[93]
。
但是融合蛋白柱上酶切存在着一定的局限性，如蛋白酶的选择，亲和柱材料的选择和
融合蛋白底物的性质都对酶切效果有一定影响。
4
2 引 言
大肠杆菌通常用于表达重组蛋白，然而，外源蛋白在大肠杆菌过度表达时，常
以包涵体的形式存在。融合标签表达可以提高蛋白的水溶性、活性及产量，也为目
的蛋白的纯化提供便利。但是，融合标签通常影响目的蛋白的结构和功能，干扰人们
对靶蛋白做进一步结构与功能分析及应用，因此在研究中通常需要将这些标签在蛋白
表达纯化之后进行切除。由于TEVp具有高效作用序列专一性，通常用于切除融合标
签，但是野生型TEVp在大肠杆菌中的表达的水溶性差并且存在分子内的自裂解。目
前已有多种方法对TEVp进行改造，如分子伴侣共表达，融合标签MBP、 GST、 s
fGFP和Streptag II等都可以提高TEVp的水溶性，但是与特定大肠杆菌分子伴侣如
DnaK、GroEL和GroES融合表达未见报道，也有研究报道大肠杆菌中编码翻译起始
因子II的基因InfB(1-21)序列作为表达标签(expressivity tag，Ex-tag)，可以通过改
变mRNA折叠来提高重组蛋白的产量，但与TEVp融合表达也没见报道；利用定点
突变技术对TEVp基因改造，常见的突变体类型有TEVp(L56V/S135G)、TEVp(T17
S/N68D/I77V)和TEVp(T17S/L56V/N68D/I77V/S135G)，Jie Fang等人在TEVp(T17
S/L56V/N68D/I77V/S135G)基础上构建了15个同义密码子突变体，筛选出水溶性得
到提高但是活性下降的TEVp
5M
(R49/R50/R101/R105)同义突变体，已有研究报道K4
5F或E106G突变可以促进TEVp蛋白的折叠。
2.1 研究目的和意义
本文的研究目的主要有五个方面：一、探明不同突变对TEVp
5M
同义突变体表达
及酶活的影响；二、探明不同标签对优化的TEVp表达及酶活影响；三、探明提高胞
内稀有tRNA水平对标签效应的影响；四、探究纯化的带不同标签TEVp的产量及酶
活；五、致力于优化出高产量、高活性的融合TEVp用于融合蛋白亲和柱上酶切，并
探明其酶切效果。
2.2 研究内容
(1)应用定点突变在TEVp
5M
同义突变体的基础上构建三个突变体K45F、E106G和
K45F/E106G
(2)分析不同突变体的表达及酶活性，筛选出最优突变体
(3)分析N端不同标签对优化的TEVp表达及活性的影响
(4)提高大肠杆菌中tRNA丰度，分析不同标签对优化的TEVp表达及活性的影响
(5)纯化带不同标签的TEVp并分析其产量及活性
(6)把构建的TEVp突变体用于5种融合蛋白的亲和柱上酶切，并分析其柱切效率
5
3 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3) 和Rosetta
TM
(DE3)感受态购自北京全式金生
物技术有限公司。载体pET-28b、pC-DJKL、pR-GESP、pET28b-tevS、pETGST-tevS、
pETMBP-tevS、pETSrx-UMT、pET-GFP、pET-TEVp
5M
等均由实验室构建并保存。
3.1.2 试剂
T4 DNA连接酶、Pyrobest聚合酶、Pfu聚合酶、Taq DNA聚合酶和限制性内切
酶购自TaKaRa宝生物工程有限公司，蛋白印迹Marker、DNA Marker和部分抗体为
全式金公司产品，SDS-PAGE用蛋白Marker由美国Fermentas生产，硝酸三乙酸亲和
介质Ni-NTA源自德国Qiagen公司，蛋白超滤管由美国Millipore公司生产，异丙基
硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)来自大连宝生物公司，苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚偏氟二乙
烯（PVDF）膜、磷酸吡哆醛（PLP）、DL-二氨基丙氨盐酸盐(DL-DAP)和2,4-二硝基
苯肼(2,4-DNP)购自美国Sigma公司。质粒提取试剂盒、胶回收DNA片段试剂盒、
PCR产物纯化试剂盒和抗生素由上海生工生物技术公司提供，引物合成和基因测序
由上海捷瑞生物工程有限公司完成，其他试剂产自中国上海生工生物技术公司，
GST-tevS-sDAL、GST-tevS-eDAL、MBP-tevS-eDAL、GST-tevS-mPrx、GST-tevS-mSrx、
GST-tevS-mSR等融合蛋白由实验室纯化。
3.1.3 仪器和设备
小型4℃冷冻离心机(Eppendorf，德国)、高压灭菌锅(Hirayama，日本)、SCS-24
稳控摇床、PCR仪(Biometra，德国)、恒温水浴锅(Grant，中国)、恒温培养箱、凝
胶成像系统(Gel Logic 212 PRO，日本)、细胞破碎仪(新芝，中国宁波)、台式高速离
心机(Sigma，美国)、蛋白电泳仪(Bio-Rad，美国)、高速冷冻离心机(Hettich，德国)、
F-4500荧光分光光度仪(Hitachi，日本)、UV-2500紫外可见分光光度仪(Hitachi
U-2900，日本)、电泳仪和半干转膜仪(Bio-Rad，美国)、分析天平(OHAUS，中国)、
照相机(Canon-450D，日本)、冰箱(美菱，中国)、通风橱(科贝科技，中国)、移液
枪(Eppendorf，德国)、超净工作台(苏州净化，中国)、电脑恒温层析柜(科力，中国)、
超低温冰箱(Sanyo，日本)。
3.1.4 部分缓冲液的配制
半干转膜缓冲液：2.93 g/L甘氨酸，17.93 g/L Tris-base，0.37g/L SDS，200 mL/L
甲醇，pH 8.3；
PBS缓冲液：0.2 g/L KH
2
PO
4
，3 g/L Na
2
HPO
4
，0.2 g/L KCl，8 g/L NaCl，pH 7.5；
6
PBST缓冲液：加0.5 mL/L Tween20于1 L PBS缓冲液；pH 7.5；
丽春红存储液：6 g水杨酸，0.4 g丽春红，6 g三氯乙酸，ddH
2
O定容20mL；
蛋白印记封闭液：取2.5 g脱脂奶粉完全溶解于PBST缓冲液中定容至50 mL，
过滤；
Lysis Buffer：6 g/L NaH
2
PO
4
，17.54 g/L NaCl，0.68 g/L咪唑，pH 8.0；
Wash Buffer：6 g/L NaH
2
PO
4
，17.54 g/L NaCl，2.72 g/L咪唑，pH 8.0；
Elution Buffer：6 g/L NaH
2
PO
4
，17.54 g/L NaCl，17 g/L咪唑，pH 8.0；
蛋白储存液：2.422 g /L Tris-HCl，5.844 g/L NaCl，pH 8.0；
显色液：0.06 g 4-氯萘酚，11 mL甲醇，PBST定容至50 mL，滤纸过滤，使用前
加34 μL 30% H
2
O
2
。
3.1.5 本研究中所需要的引物
表1 研究中所用的引物序列
Table 1 The primes used in this study
Primer Sequence(5’-3’) Usage
K45F1 F: CAAACTTCCACTTGTTTCGACGAAATAATG K45F
K45F2 R: CTAAACAAGTGGAAGTTTGTAATGATGAAG
E106G1 F: ACAACGTGGTGAGCGCATTTGTCTTGTGAC E106G
E106G2 R: CGCTCACCACGTTGTGGCTCGCGAAATTTC
Ex-tag1 F: TATGACAGATGTAACGATTAAAG Ex-tag
Ex-tag2 R: GATCCTTTAATCGTTACATCTGTCA
GroES1 F: TCTAGTGCATATGAATATTCGTCCATTG Nde I
GroES2 R: ATAGATCTACCGCCCGCTTCAACAATTG
Bgl II
GroEL1 F: ATCTCTCATATGGCAGCTAAAGACGTAAAATTC Nde I
GroEL2 R: GCTAGATCTTAAGTCAGCTGCATCGTTTTTC
Bgl II
I DnaK1 F: GACTCACATATGGGTAAAATAATTGGTATC Nde
DnaK2 R: TATGGATCCAAATTCAGCGTCGACAACATC BamH I
Srx
1
F:TTAGATCTCATATGTCGAGTTCGACCCTGG Nde I
Srx
3 R:CTCAAGCTTATCGCATGTGGTGCCTCAGTG Hind III
sDAL 1 F:TCGGATCCCATATGCATGAGCTTATTAAATATC BamH I
sDAL2 R:GATCTCGAGTTAAGCACTGCGTCCGTTCCAGACT
Xho I
F:forward primer; R: reverse primer. The restriction endonuclease recognition sequence was underlined.
7
3.2 方法
3.2.1 载体构建的相关反应体系
(1)PCR扩增体系为：
ddH
2
O 37 µL
10×Pfu Buffer 5 µL
2.5 mmol/L dNTPs 4 µL
引物1
引物2
模板
Pfu polymerase
(2)PCR扩增程序为：
94℃
94℃
56℃
72℃
72℃
(3)磷酸化反应体系：
ddH
2
O
消化产物
10×T4 Polynucleatide kinase buffer
100 mM ATP 0.1
T4 Polynucleatide kinase 0.5
(4)磷酸化产物连接体系：
ddH
2
O
磷酸化产物 1.5µL
10×T4 Liguse buffer
T4 DNA Ligase 1.5
(5)双酶切的反应体系：
ddH
2
O
质粒
10×Buffer
酶1
酶2
8
1 µL
5min
30 s
30 s
3 min
10 min
4.5 µL
4 µL
1 µL
µL
µL
1 µL
µL
μL
15μL
3 μL
1 μL
1 μL
1 µL
1 µL
1 µL
6 µL
10
(6) 片段与载体连接反应体系：
目的片段 6 μL
载体 2 μL
10×T4 Ligase Buffer 1 μL
T4 DNA Ligase 1 μL
3.2.2 构建烟草蚀斑病毒蛋白酶突变体K45F、E106G和K45F/E106G
设计引物K45F1和K45F2(见表1)，以pET-TEVp
5M
质粒为模板，进行突变体
pET-K45F的PCR扩增，PCR反应体系和条件如3.2.1所示，共30个循环，用PCR
回收试剂盒直接回收PCR产物，PCR产物加入1 µL Dpn I消化过夜来去除模板DNA，
把消化产物进行37℃，磷酸化1 h，磷酸化反应体系如3.2.1所示。磷酸化产物70℃
灭活10 min，跑1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收之后，进行磷酸产物连接，连接体系
如3.2.1所示，16℃反应4 h。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴
30 min，42℃热击90 s，再冰浴5 min后加入100 µL新鲜的LB液体培养基，180 rpm，
37℃摇床培养1 h，均匀涂在含有0.05 mg/mL的硫酸卡那霉素的LB固体培养皿上，
37℃倒置培养过夜。挑取单克隆菌斑，摇菌，菌液送上海英骏生物技术有限公司进行
测序，我们把测序正确的命名质粒pET-K45F。
以测序正确的质粒进行第二轮的突变，第二轮的引物为E106G1和E106G2(见表
1),方法及条件同第一轮突变，将两轮突变后测序正确的突变体质粒命名为
pET-K45F/E106G。
设计引物E106G1和E106G2(见表1)，以pET-TEVp
5M
质粒为模板，进行突变体
pET-E106G的PCR扩增，共30个循环，用PCR回收试剂盒直接回收PCR产物，PCR
产物加入1 µL Dpn I消化过夜来去除模板DNA，把消化产物进行37℃，磷酸化1 h。
磷酸化产物70℃灭活10 min，跑1% 琼脂糖凝胶电泳，切胶回收之后，进行磷酸产
物连接，16℃反应4 h。连接产物转化到大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。挑取单克
隆菌斑，摇菌37℃摇床培养12 h，菌液送上海英骏生物技术有限公司进行测序，我
们把测序正确的命名质粒pET-E106G。
3.2.3 构建带不同标签的E106G融合表达载体
已有研究报道TEVp与大肠杆菌分子伴侣共表达时提高了其在中的可溶性
表达
[28-29]
，最近研究表明，特定的大肠杆菌分子伴侣与目的蛋白融合表达，也可提高
融合蛋白的可溶性
[52]
。因此本研究设计引物GroEL1和GroEL2(见表1)，以载体
pR-GESP为模板克隆groEL片段，PCR反应体系和条件如3.2.1所示，共30个循环，
其中72℃延伸120 s。PCR产物跑1% 琼脂糖凝胶电泳，切胶回收之后，用Nde I和
Bgl II双酶切，用同样的酶双酶切pETGST-tevS-E106G载体，反应体系为3.2.1所示，
37℃酶切过夜。酶切产物跑1% 琼脂糖电泳，切胶回收目的片段和载体，并纯化。酶
9
切后的目的片段与载体进行连接，连接反应体系为3.2.1所示，16℃反应4 h，转化大
肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。挑取单菌斑，摇菌37℃摇床培养12 h，提取质粒，进
行酶切验证，得到质粒pETGroEL-tevS-E106G。
设计引物GroES1和GroES2(见表1)，以载体pR-GESP为模板克隆groEL片段，
PCR反应体系和条件如3.2.1所示，共30个循环，其中72℃延伸30 s。PCR产物跑
1% 琼脂糖凝胶电泳，切胶回收之后，用Nde I和Bgl II双酶切，用同样的酶双酶切
pETGST-tevS-E106G载体，37℃酶切过夜。酶切产物跑1% 琼脂糖电泳，切胶回收
目的片段和载体，并纯化。酶切后的目的片段与载体进行连接，16℃反应4 h，转化
大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。挑取单菌斑，摇菌37℃摇床培养12 h，提取质粒，
进行酶切验证，得到质粒pETGroES-tevS-E106G。
设计引物DnaK1和DnaK2(见表1)，以载体pC-DJKL为模板克隆片段dnaK，
PCR反应体系和条件如3.2.1所示，共30个循环，其中72℃延伸130 s。PCR产物跑
1% 琼脂糖凝胶电泳，切胶回收之后，用Nde I和Bgl II双酶切，用同样的酶双酶切
pETGST-tevS-E106G载体，37℃酶切12 h。酶切产物跑1% 琼脂糖电泳，切胶回收
目的片段和载体，并纯化。酶切后的目的片段与载体进行连接，16℃反应4 h，转化
大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，挑取单菌斑，摇菌37℃摇床培养12 h，提取质粒，
进行酶切验证，得到质粒pETDnaK-tevS-E106G。
大肠杆菌中编码翻译起始因子II的基因InfB(1-21)序列作为表达标(expressivity
tag，Ex-tag)可以通过改变mRNA折叠来提高重组蛋白的产量
[51]
，但是与TEVp融合
表达未见报道，因此本研究通过PCR技术将Ex-e106g基因扩增出来。第一步引物磷
酸化，反应体系为21 μL，15.5 µL ddH
2
O，2 µL 10× T4 Polynucleotide kinise Buffer，
0.5 µL ATP，1 µL T4 PNK，1 µL Ex-tag1，1 µL Ex-tag2，37℃反应1 h，70℃灭活10 min
后冷却至室温。NdeI、Bgl II双酶切pETGST-tevS-E106G载体，37℃酶切过夜，酶切
产物跑1% 琼脂糖电泳，切胶回收载体，并纯化。15 μL纯化载体，2 μL磷酸化引物，
在60℃水浴加热2 min，冷却至室温，冰浴后连接，连接体系为10 μL，依次加入3 μL
ddH
2
O,5 μL引物载体混合物，10×T4 Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL。16℃，
反应4 h。转化大肠杆菌DH5α感受态中，37℃培养过夜，挑斑摇菌，提取质粒，质
粒送去上海英骏生物技术有限公司进行测序，我们把测序正确的命名质粒
pET-Ex-E106G。
已有报道在与MBP融合时提高了TEVp在的可溶性表达
[94]
，因此我们用
Nde I和Bgl II双酶切质粒pETMBP-tevS和pETGST-tevS-E106G，反应体系及条件同
上。酶切产物跑1% 琼脂糖电泳，切胶回收目的片段和载体，并纯化。酶切后的目的
片段与载体进行连接，16℃反应4 h，转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。挑斑，
摇菌，提取质粒，进行酶切验证，得到质粒pETMBP-tevS-E106G。
10
用Bgl II和BamH I双酶切载体pETMBP-tevS-E106G,反应体系及条件同上，验
证阳性克隆得到质粒pETMBP-E106G-H6。
3.2.4 用于柱上酶切5种融合蛋白底物的表达载体构建
据报道成熟玉米硫过氧化物还原蛋白(maize sulfiredoxin,mSrx)水溶性不高，因
此我们设计了引物Srx1和Srx3(见表1)，以载体pSrx-UMT为模板克隆Srx片段，反
应体系如3.2.1所示，其中72℃延伸30 s，共30个循环。PCR产物跑1% 琼脂糖电
泳，切胶回收目的片段，Nde I和Hind III双酶切回收产物和载体pETGST-tevS，37℃
酶切过夜。1% 琼脂糖电泳，切胶回收目的片段和载体，并纯化。酶切后的目的片段
与载体进行连接，16℃反应4 h，转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。挑取单菌斑，
摇菌37℃摇床培养12 h，提取质粒，进行酶切验证，得到质粒pETGST-tevS-mSrx。
CTAB/NaCl法提取鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA，设计引物sDAL1和sDAL2(见
引物表1)，以鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)基因组DNA为模板，克隆2,3-
二氨基丙氨脱氨酶(2,3-diaminopropionate ammonia-lyase，sDAL)基因大小约为1200
bp，反应体系如3.2.1所示，其中72℃延伸120 s，共30个循环。PCR产物跑1% 琼
脂糖电泳，切胶回收目的片段，BamH I和Xho I双酶切回收产物和pETGST-tevS,37℃
酶切过夜。1% 琼脂糖电泳，切胶回收目的片段和载体，并纯化。酶切后的目的片段
与载体进行连接，16℃反应4 h，转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。挑取单菌斑，
摇菌37℃摇床培养12 h，提取质粒，进行酶切验证，得到质粒pETGST-tevS-sDAL。
CTAB/NaCl法提取大肠杆菌基因组DNA，设计引物eDAL1和eDAL2，以大肠
杆菌(Escherichia ,coli)基因组DNA为模板，克隆2,3-二氨基丙氨脱氨酶
(2,3-diaminopropionate ammonia-lyase，eDAL)基因的大小约为1200 bp，反应体系如
3.2.1所示,其中72℃延伸120 s，共30个循环。PCR产物跑1% 琼脂糖电泳，切胶回
收目的片段，BamH I和Xho I双酶切回收产物和载体pETMBP-tevS,以同样的方法连
接，转化，挑斑摇菌，提取质粒，进行酶切验证，得到质粒pETMBP-tevS-eDAL。
融合载体pETGST-tevS-mPrx和pETGST-tevS-mSR由实验室之前构建好，其中玉
米的D-丝氨酸消旋酶(maize D-serine racemase，mSR)和玉米2-半胱氨酸过氧化物还
原酶A(maize 2-Cys peroxiredoxin A，mPrx)都是从玉米基因组中克隆出的成熟蛋白。
3.2.5 不同TEVp突变体的表达分析
把构建好的质粒pET-K45F、pET-K45F/E106G、pET-E106G和对照质粒
pET-TEVp
5M
转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落于5 mL的LB液体培养基(培
养基中加入终浓度50 mg/L的卡那霉素，菌株的LB液体培养基pH 8.5)中，37℃，
220 rpm培养至菌液OD
600
约为0.6时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，28℃，220 rpm
诱导表达12 h，收取诱导后的菌液，12,000 rpm冷冻离心1 min收集菌体，并用蛋白
储存液悬浮、清洗菌体两次，加入蛋白储存液，在冰浴下超声波破碎(功率300 W，
11
每次1 s，间隔3 s，共99次)，在4℃下12,000 rpm离心15 min，收集上清液。把沉
淀再用蛋白储存液清洗三次，最后用尿素溶解沉淀，在4℃下12,000 rpm离心15 min，
收集上清，去沉淀用Bradford法检测蛋白浓度，上清液按1:5加入5×Loading Buffer
中煮沸10 min后上样，15% SDS-PAGE电泳和His6抗体蛋白印迹分析不同TEVp突
变体在上清沉淀中的表达。
蛋白印迹(Western Blotting，WB)分析具体操作步骤如下：
(1)30 μg破碎上清蛋白样品经12% SDS-PAGE电泳后，用剪刀裁剪滤纸和PVDF
膜尺寸大小和电泳胶的大小一致，将PVDF膜浸泡在甲醇中1-2 min予以活化，与滤
纸和SDS电泳胶需浸泡在冰冷的转膜缓冲液中平衡5 min。将滤纸、PVDF膜、SDS
电泳胶、滤纸依次按照正极到负极的顺序放置，设置半干转膜仪，20 V恒压，60 min
半干式转膜法转至PVDF膜上。转膜完成之后可用丽春红染液检测转膜是否成功。
(2)膜的封闭：将经上述步骤得到的PVDF膜于封闭液中4℃摇床上轻轻摇动过
夜封闭。
(3)免疫检测：将一抗用PBST缓冲液稀释至适当浓度，从封闭液中取出膜放于
含有一抗的PBST缓冲液中，4℃下过夜孵育后，用PBST缓冲液在室温下摇床上轻
轻摇动清洗3-4次，每次5 min，将膜转至到二抗稀释液中，室温下孵育2 h后，用
PBST缓冲液在室温下清洗1次。
(4)显色：将膜转移至现配显色液中，摇床轻轻晃动5 min左右，待显色完全之
后，拍照。
3.2.6 GFP荧光强度检测不同TEVp突变体水溶性表达
分别将构建好的质粒pET28GFP-K45F，pET28GFP-K45F/E106G，
pET28GFP-E106G及实验室保存的对照质粒pET28GFP-TEVp
5M
转化大肠杆菌
BL21(DE3)，挑取单菌斑，摇菌5 mL，在LB中加入终浓度为0.05 mg/mL的硫酸卡
加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃那霉素，37℃，220 rpm，至菌液OD
600
约为0.7，
诱导12 h，离心收集菌体，用蛋白储存缓冲液清洗两次，加入蛋白储存液，在冰浴下
超声波破碎(功率300 W，每次1 s，间隔3 s，共99次)，在4℃下12,000 rpm离心
15 min，测上清液的荧光值，Ex=488/Em=510－530分析其表达水平，把沉淀再用蛋
白储存液清洗三次，最后用尿素溶解沉淀，在4℃下12,000 rpm离心15 min，收集上
清，去沉淀用Bradford法检测蛋白浓度，上清液按1:5加入5×Loading Buffer，离心
弃沉淀，12% SDS-PAGE电泳，紫外光下拍照记录电泳结果。
3.2.7 不同TEVp突变体的活性分析
取离心后上清液，测不同TEVp突变体活性，采用DAL丙酮酸法，分别在总蛋
白含量为20 μg溶液中加入100 μg纯化的融合蛋白底物GST-TevS-DAL，每组实验设
置三个重复，30℃孵育1 h后测定TEVp切割蛋白底物的活性，在50 μM PLP和10 mM
12
DL-DAP溶液中，加入酶切反应体系至终体积为1 mL。37℃反应5 min后加入1 mL 的
2M HCl(含有0.03% (w/v) 2,4-DNP)终止反应，4℃静置5 min后加入2 mL的 2M
NaOH染色，室温反应10 min后，测定520 nm的光吸收值。另外，取50 μg反应体
系蛋白，按1:5加入5×Loading Buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE分析。
3.2.8 带不同标签的E106G融合蛋白的表达及活性分析
将构建好的表达不同标签的TEVp突变体的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或
Rosetta
TM
(DE3)中，挑斑，摇菌5 mL，加入终浓度为50 mg/L的硫酸卡那霉素，37℃，
220 rpm，至菌液OD
600
约为0.6，加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃诱导12 h，离
心收集菌体，用蛋白储存缓冲液清洗两次，加入蛋白储存液，在冰浴下超声波破碎(功
率300 W，每次1 s，间隔3 s，共99次)，4℃下12,000 rpm离心15 min，收集上清，
电泳和蛋白印迹分析可溶性靶蛋白的表达。TEVp活性同3.2.7描述。
3.2.9 融合蛋白的诱导表达纯化及产量测定
(1)将构建好的pET28-tevS-E10G、pETGroEL-tevS-E106G、pETMBP-tevS-E106G、
pETEx-E106G、pETMBP-E106G-H6和在3.2.4中构建好的5种融合蛋白底物载体转
入大肠杆菌Rosetta
TM
(DE3)感受态细胞，挑斑，摇菌5 mL，37℃，220 rpm过夜培养，
按1:200转入1L培养基中扩大培养。
(2)至菌液OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mM，在28℃，220 rpm
下诱导12 h。
(3)7000 rpm 4℃冷冻离心10 min收集菌液，并用蛋白储存液将菌体悬浮清洗2
次。
(4)加入30 mL的Lysis Buffer，在冰浴下超声破碎(功率300 W，每次3 s，间隔
9 s，共99次)。
(5)破碎好的蛋白液7000 rpm冷冻离心30 min，弃沉淀，再重复高速离心一次，
离心的同时，Ni-NTA胶用Elution Buffer清洗三个柱体积，再用Lysis Buffer平衡三
个柱体积，上清液与Ni-NTA(2mL)胶结合20 min后，弃流出液，用Lysis Buffer清
洗三个柱体积后，再用Wash Buffer清洗三个柱体积，以去除杂蛋白，最后用Elution
Buffer洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。
以1:5的体积比加入5×SDS-PAGE (6)取50 μL Elution Buffer洗脱下的目的蛋白，
Loading Buffer，沸水浴10 min，SDS-PAGE电泳检测是否纯化到目的蛋白。
(7)用超滤管浓缩其余目的蛋白上清液，4000 rpm，4℃冷冻离心，超滤时用蛋白
储存液置换Elution Buffer直到将总体积浓缩到1 mL左右，用Bradford法检测蛋白浓
度，分装，并放置于-70℃保存备用。
(8)用Bradford法分别测定pET28-tevS-TEVp
5M
、pET28-tevS-E106G、
GroEL-tevS-E106G、MBP-tevS-E106G、Ex-E106G的蛋白浓度，计算各自在1 L培养
13
基中的表达量。
3.2.10 纯化的TEVp活性分析
分别在40 μg纯化的TEVp蛋白酶中加入200 μg融合蛋白底物GST-TevS-DAL，
在30℃下恒温反应1 h，同等条件下以高温失活的E106G为对照，测不同突变体的活
性。反应体系为1 mL：50 μM PLP，10 mM DL-DAP，含有50 μg纯化的底物蛋白的
上述反应液，37℃反应5 min，加入1 mL 2M HCl(含有0.03% (w/v) 2,4-DNP)终止反
应，4℃ 5 min后加入2 mL 2 M NaOH染色，室温10 min后于分光光度计520 nm处
测量吸光值，分析不同纯化的融合蛋白酶活性。
3.2.11 MBP-E106G-H6用于融合蛋白的亲和柱上酶切效率分析
分别在200 μg纯化的带H6GST标签的融合蛋白底物中加入10 μg融合蛋白酶
MBP-E106G-H6，然后把酶反应液分别固定在Ni
2+
树脂上(Ni
2+
柱用之前先用蛋白储存
液平衡柱子)，4℃酶切12 h后，先用Lysis Buffer洗脱掉目的蛋白，再用Elution Buffer
把其他结合在柱上的蛋白洗脱掉，把每一步骤洗脱液用Bradford法检测蛋白浓度，以
1:5的体积比加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴10 min，SDS-PAGE电泳检测
柱上酶切效率，再对应的用His6抗体做蛋白印迹进一步检测酶切效果，每个泳道都
定量5 μg蛋白，Western Bloting分析具体操作方法如3.2.5中所述。在200 μg纯化的
MBP-tevS-eDAL融合蛋白底物中加入10 μg融合蛋白酶MBP-E106G-H6，然后把酶
反应液固定在麦芽糖树脂上，4℃酶切12 h后，先用洗柱液(200 mM NaCl，20 mM
Tris-HCl，1 mM EDTA-Na
2
，1 mM DTT，1 mM PMSF，pH 7.5)洗脱掉目的蛋白，再
用洗脱液(200 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，1 mM DTT，1 mM EDTA-Na
2
，1 mM PMSF，
10 mM maltose，pH 7.5)洗脱掉结合在柱子上的蛋白，把每一步骤洗脱液用Bradford
法检测蛋白浓度，以1:5的体积比加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴10 min，
SDS-PAGE电泳检测柱上酶切效率，再对应的用MBP抗体做蛋白印迹进一步检测酶
切效果，每个泳道都定量5 μg蛋白，Western Bloting分析具体操作方法如3.2.5中所
述。
14
4 结果与分析
4.1 载体构建
已有报道对野生型TEVp进行K45F或E106G定点突变，可提高该蛋白酶的折叠
和蛋白表达水平
[109]
，虽然TEVp
5M
同义突变体在大肠杆菌两个菌株BL21(DE3)和
Rosetta
TM
(DE3)中的可溶性表达已经得到很大的改善，但是活性下降。为了进一步改
善TEVp
5M
同义突变体的表达和活性，我们在TEVp
5M
同义突变体的基础上分别进行
了K45F、E106G和K45F/E106G定点突变，构建表达N端和C端都带组His6标签
的TEVp突变体，用于不同突变体筛选及蛋白纯化(图4-1 A)；构建表达N端带His6
标签C端带GFP标签的TEVp突变体，用于定量检测突变体蛋白水溶性表达(图4-1
B)；为了进一步提高优化TEVp的水溶性，构建表达带蛋白标签，TEVp识别序列，
E106G突变体和C端带His6标签的融合蛋白，用于分析不同标签对TEVp表达及活
性的影响(图4-1 C)。以及构建表达不含TEVp识别序列的融合蛋白，用于分析融合
蛋白中TEVp识别序列的作用(图4-1 D)。
图4-1 载体构建
Fig. 4-1 Vector Construction
(A)：构建的N带和C端都带组His6标签的TEVp突变体；(B)：构建的N端带His6标签C端带GFP标签的
TEVp突变体；(C)：构建用于表达带蛋白标签，TEVp识别序列，E106G突变体和C端带His6标签的融合蛋白；
(D)：构建不带TEVp识别序列的融合TEVp突变体
(A)：The constructed TEVp variant with the dual His6-tag at N and C-terminus；(B)：The constructed TEVp variant with
the N-terminal His6-tag and C-terminal GFP；(C)：The expressed fusion protein including the protein tag the TEVp
recognition sequence，the E106G variant and a C-terminal His6-tag；(D)：The constructed fusioned TEVp variant without
the TEVp recognition sequence
15
4.2 定性定量分析不同TEVp突变体的表达
把构建好的pET-K45F、pET-E106G和pET-K45F/E106G质粒转到大肠杆菌BL21
（DE3）中，其中以pET-TEVp
5M
同义突变体做对照，28℃条件下，0.5 mM IPTG诱
导12 h，利用15% SDS-PAGE电泳和对应His6抗体蛋白印迹分析不同TEVp突变体
在上清和沉淀中的表达，只有E106G突变体的水溶性比对照高，K45F和K45F/E106G
两个突变体水溶性反而降低(图4-2 A-B)。为了定量检测不同TEVp突变体的水溶性
表达，将C端融合EmGFP报告基因的TEVp突变体质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)
中，分别测定其在破碎上清中的荧光强度值，显示E106G突变体荧光值比对照高28%，
而其他两个突变体荧光值都低于对照(图4-2 D)，说明E106G突变提高TEVp
5M
同义
突变体的水溶性表达。为了定性检测GFP融合蛋白的可溶性表达水平，GFP活性电
泳显示K45F、E106G和K45F/E106G在上清和沉淀中的表达水平(图4-2 C)与GFP
定量检测结果相一致即：不同TEVp突变体中，只有E106G突变提高了TEVp
5M
同义
突变体的水溶性。
图4-2不同TEVp突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
Fig. 4-2 Expression of the constructed TEVp variants in E. coli BL21(DE3).
(A)：SDS-PAGE分析不同TEVp突变体表达( M：蛋白maker；S:上清；P:沉淀)；(B)：His6抗体蛋白印迹分析
不同TEVp突变体表达；(C)：SDS-PAGE可视化分析突变体的表达；(D)：不同TEVp突变体在破碎上清中荧光
强度
(A)：SDS-PAGE analysis of the TEVp variants expression(M：Protein Maker；S：soluble proteins；P: pelleted proteins)；
(B)：Western blot ofthe TEVp variants expression using anti-His6 antibody；(C)：SDS-PAGE analysis of the expressed
variants followed by visualization under UV light；(D)：The fluorescence intensities of soluble fractions of cells
expressing TEVp variants
16
4.3 定性定量分析不同TEVp突变体的活性
上清中不同TEVp突变体的酶活性测定采用DAL丙酮酸法，分别在总蛋白含量为20
μg的不同突变体的破碎液中加入100 μg融合蛋白底物GST-TevS-DAL，每组突变体
取三个平行样，30℃恒温孵育1 h后测定蛋白酶活性。利用SDS-PAGE电泳定性分析
不同TEVp突变体破碎上清液作用于融合蛋白底物的催化能力(图4-3 A),对应催化产
物DAL活性分析，E106G突变体催化能力比对照TEVp
5M
同义突变体高32%，而其
他两个突变体的催化能力低于TEVp
5M
同义突变体(图4-3 B)，表明只有E106G突变
促进了TEVp的折叠。因此，E106G突变能提高TEVp
5M
同义突变体在大肠杆菌
BL21(DE3)菌株中的水溶性和活性。
图4-3不同TEVp突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中的活性
Fig. 4- 3 Activity of the constructed TEVp variants in E. coli BL21(DE3)
(A)：SDS-PAGE分析TEVp突变体破碎上清的酶活(M:蛋白Mark；CK：对照)；(B)：不同TEVp突变体破碎
上酶活性
(A)：SDS-PAGE analysis of the TEVp variants activity in crude extracts(M：Protein Mark；CK：contrast)；(B)：Activity
of TEVp variants in crude extracts
4.4 分析不同标签对E106G蛋白酶表达及活性影响
为了进一步提高突变体E106G蛋白的水溶性，我们在E106G突变体N端分别融
合不同标签如His6、MBP、GroEL、GroES和DnaK，C端融合His6标签，并且在N
端融合标签与E106G蛋白酶之间加入了TEVp蛋白酶的识别序列tevS，把已构建好
的表达分子内自剪切融合蛋白酶质粒和pET-Ex-E106G质粒转化到大肠杆菌
BL21(DE3)中，28℃，0.5 mM IPTG诱导12 h。由于融合蛋白酶分子内存在TEVp识
别序列，因此融合蛋白表达的同时，E106G通过自剪切作用从不同标签上被释放出来。
通过SDS-PAGE和对应His6抗体蛋白印迹检测到融合蛋白酶可以完全被切开，E106G
被完全从不同标签上释放出来，其中MBP、GroEL、GroES和DnaK都提高了E106G
蛋白酶的水溶性表达，其中DnaK和MBP对改善TEVp突变体水溶性效果最好，而
17
Ex-tag则降低了融合蛋白酶的表达(图4-4 A-B)。
以同等比例(5:1)在融合蛋白底物GST-TevS-DAL中加入带不同标签突变体的破
碎上清液，30℃恒温孵育1 h，同样用丙酮酸法测定从不同标签上被释放出E106G和
Ex-E106G在破碎上清中的酶活，SDS-PAGE电泳定性分析被释放出的E106G和
Ex-E106G在破碎上清液作用于融合蛋白底物的催化能力(图4-4 C)，对应催化产物
DAL活性分析，只有GroEL、MBP标签提高了该E106G的催化能力，而GroES和
DnaK降低了E106G的催化能力，而Ex-tag相对于His6-tag则明显的降低了E106G
的活性，可能是由于其表达水平低的原因(图4-4 D)。
图4-4 带不同标签的E106G在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达及活性
Fig. 4-4 Soluble expression and activity of the E106G variant with different fusion tags in BL21(DE3)
(A)：SDS-PAGE分析重组蛋白在破碎上清中的表达；(B)：His6抗体蛋白印迹分析重组蛋白在破碎上清中表达；
(C)：SDS-PAGE分析重组蛋白切割活性；(D)：相对应的重组蛋白切割活性值分析(1：E106G；2：Ex-E106G；
3： GroEL-tevS-E106G； 4：GroES-tevS-E106G；5：DnaK-tevS-E106G ；6：MBP-tevS-E106G)
(A)：SDS-PAGE analysis of recombinant proteins expression in supernatants；(B)：Western blot analysis of recombinant
proteins expression in supernatants using anti-His6 antibody；(C)：SDS-PAGE analysis of the cleavage activity of the
recombinant proteins；(D)：The coupled assay of the cleavage activity of recombinant proteins(1：E106G；2：Ex-E106G；
3: GroEL-tevS-E106G； 4：GroES-tevS-E106G；5：DnaK-tevS-E106G；6:MBP-tevS-E106G)
4.5 分析提高胞内稀有tRNA水平对标签效应的影响
Rosetta
TM
(DE3)除了提供大肠杆菌稀有的精氨酸密码AGA和AGG外，还提供
大肠杆菌偏少的异亮氨酸的密码子AUA、亮氨酸的密码子CUA、甘氨酸的密码子
GGA和脯氨酸的密码子CCC，这六种密码子也存在TEVp的编码序列中。为了探明
稀有tRNA丰度对带不同标签E106G蛋白酶表达及活性的影响，将已构建好的载体
18
分别转化到大肠杆菌Rosetta
TM
(DE3)中，28℃，0.5 mM IPTG诱导12 h。通过
SDS-PAGE电泳和对应His6抗体的蛋白印迹分析显示融合蛋白可以完全被切开，
E106G被完全从不同标签上释放出来，MBP、GroEL、GroES、DnaK和Ex标签都提
高了E106G的水溶性表达，其中InfB(1–21)序列和MBP提高TEVp突变体水溶性效
果最好(图4-5 A-B)。
以同等比例(5:1)在融合蛋白底物GST-TevS-DAL中加入带不同标签突变体的破
碎上清液，30℃恒温孵育1 h，同样用丙酮酸法测定从不同标签上被释放出E106G和
Ex-E106G在破碎上清中的酶活，SDS-PAGE电泳定性分析被释放出的E106G和
Ex-E106G在破碎上清液作用于融合蛋白底物的催化能力(图4-5 C)，对应催化产物
DAL活性分析，其中Ex-E106G催化活性最高，可是由于其表达量升高的原因。在4
种蛋白标签中只有GroEL提高了E106G的活性，MBP提高了E106G的表达但是其
活性显著下降，双His6标签的E106G表达量也下降(图4-5 D)。结果表明稀有tRNA
丰度影响标签对E106G的促进作用。
图4-5 带不同标签的E106G在大肠杆菌中Rosetta
TM
(DE3)的水溶性表达及活性
Fig. 4-5 Soluble expression and activity of the E106G variant with different fusion tags in Rosetta
TM
(DE3)
(A)：SDS-PAGE分析重组蛋白在破碎上清中的表达；(B)：His6抗体蛋白印迹分析重组蛋白在破碎上清中表达；
(C)：SDS-PAGE分析重组蛋白切割活性；(D)：相对应的重组蛋白切割活性值分析(1：E106G；2：Ex-E106G；
3：GroEL-tevS-E106G；4：GroES-tevS-E106G；5：DnaK-tevS-E106G；6：MBP-tevS-E106G)
(A)：SDS-PAGE analysis of recombinant proteins expression in supernatants；(B)：Western blot analysis of recombinant
proteins expression in supernatants using anti-His6 antibody；(C)：SDS-PAGE analysis of the cleavage activity of the
recombinant proteins；(D)：The coupled assay of the cleavage activity of recombinant proteins(1：E106G；2：Ex-E106G；
3：GroEL-tevS-E106G；4：GroES-tevS-E106G；5：DnaK-tevS-E106G；6：MBP-tevS-E106G)
19
4.6 分析融合蛋白中TEVp识别序列的作用
通过综合分析不同标签对E106G蛋白酶表达及活性影响，我们得出MBP-tevS
-E106G在BL21(DE3)中表达上清的酶活性最高，而在Rosetta
TM
(DE3)中表达上清中
的活性最低，因此我们尝试着把MBP标签与目的蛋白之间的TEVp识别序列去掉，
来进一步研究MBP-E106G-H6分别在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta
TM
(DE3)中水溶
性和活性。把质粒pETMBP-E106G-H6分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)和
Rosetta
TM
(DE3)中，28℃，0.5 mM IPTG诱导12 h,利用12% SDS-PAGE和蛋白印迹
分析此融合蛋白分别在两个菌株中在破碎上清中表达，得出MBP-E106G-H6在大肠
杆菌两种菌株中的水溶性没有提高(图4-6 A)。
以同等比例(5:1)在融合蛋白底物GST-TevS-DAL中加入不同菌株中此蛋白的破
碎上清液，30℃恒温孵育1 h，同样用丙酮酸法测定MBP-E106G-H6的酶活，利用12%
SDS-PAGE电泳定性分析MBP-E106G-H6的破碎上清液作用于融合蛋白底物的催化
能力(图4-6 B)，对应催化产物DAL活性分析，MBP-E106G-H6在Rosetta
TM
(DE3)
和BL21(DE3)中酶活基本相似并且与MBP-tevS-E106G在BL21中活性基本一样（图
4-6 C）。结果表明去掉tevS后，MBP并没有提高E106G的水溶性，但是提高了E106G
在大肠杆菌Rosetta
TM
(DE3)菌株中的活性。
图4-6 MBP-E106G-H6在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta
TM
(DE3)两种菌株中的水溶性表达和活性
Fig. 4-6 Soluble expression and activity of the MBP-E106G-H6 in E. coli BL21(DE3) and Rosetta
TM
(DE3)
(A)：SDS-PAGE和蛋白印迹分析MBP-E106G-H6的破碎上清中表达(下端为对应MBP抗体印迹；1：BL21(DE3)；
2：Rosetta
TM
(DE3))；(B)：SDS-PAGE分析重组蛋白切割活性(1：CK；2：BL21(DE3)；3：Rosetta
TM
(DE3))；(C)：
MBP-E106G-H6在破碎上清中酶活性(1:BL21(DE3)；2：Rosetta
TM
(DE3))
(A)：SDS-PAGE and Western blot analysis of MBP-E106G-H6 expression in supernatant( Western blotting using
(B)：SDS-PAGE analysis of the cleavage anti-His6 antibody are displayed at bottom；1：BL21(DE3)；2：Rosetta
TM
(DE3))；
activity of the recombinant proteins(1：CK；2：BL21(DE3)；3：Rosetta
TM
(DE3))；(C)：Activity assay of the MBP-
E106G-H6 in supernatant(1：BL21(DE3)；2：Rosetta
TM
(DE3))
4.7 带不同标签的E106G产量和活性的分析
把载体pETMBP-tevS-E106G转化到Rosetta
TM
(DE3)扩大培养，细胞破碎上清液
过2 mL Ni-NTA介质纯化，由于分子内存在TEVp识别序列，融合蛋白在表达的过程
20
中，融合标签被E106G剪切掉，通过Ni-NTA介质时，目的蛋白E106G-His6结合到
介质上，而融合标签在低浓度咪唑洗柱液洗脱的过程中被除去，高浓度咪唑洗脱掉结
合在柱子上的目的蛋白E106G-H6，12% SDS-PAGE电泳检测显示一条主带，亚基分
子量大小约为27 kDa，说明纯化得到纯度较高的目的蛋白E106G-H6(图4-7 A)。同
样的方法纯化融合蛋白MBP-E106G-H6，利用12% SDS-PAGE电泳检测显示得到的
目的蛋白也为一条主带，说明得到纯度较高的目的蛋白MBP-E106G-H6(图4-7 B)，
也纯化了融合蛋白Ex-E106G,GroEL-tevS-E106G,H6-E106G,利用12% SDS-PAGE电
泳检测同样也纯化得到纯度较高的目的蛋白(在此没有图谱显示)。我们测定了带双组
氨酸标签的E106G、从标签GroEL和MBP上释放出的E106G、Ex-E106G及
MBP-E106G-H6融合蛋白产量分别为：147、176、221、198和645mg/L(图4-7 C)。
以比例(20:1)在融合蛋白底物GST-TevS-DAL中加入纯化的带不同标签的E106G，
30℃恒温孵育1h，同样用丙酮酸法测定E106G的酶活为：0.251、0.212、0.198、0.164
和0.382(图4-7 D)。从产量和活性值表明即使有蛋白标签的作用，纯化的TEVp不同
时具备最优化的产量和质量，但是MBP-E106G-H6融合蛋白酶产量高、活性也高。
图4-7 TEVp的产量及活性分析
Fig. 4- 7 Yield and activity analysis of the TEVp
(A)：SDS-PAGE分析MBP-tevS-E106G-H6在Ni-NTA上的纯化步骤；(B)：SDS-PAGE分析MBP-E106G-H6融
合蛋白的纯化；(C)：纯化得到TEVp的产量(1：H6-E106G；2：GroEL-tevS-E106G；3：Ex-E106G；4：
MBP-tevS-E106G；5：MBP-E106G)；(D)：纯化得到相对应的E106G的活性值
(A)：SDS-PAGE analysis of purification steps of the MBP-tevS-E106G-H6 by Ni-NTA Superflow；(B)：Purification of the
E106G variant with N-terminal MBP and C-terminal His6-tag by Ni-NTA Superflow；(C)：Yields of different TEVp
constructs by affinity purification and concentration from 1L LB culture(1：H6-E106G；2：GroEL-tevS-E106G；3：
Ex-E106G；4：MBP-tevS-E106G；5：MBP-E106G)；(D)：Specific activity of the corresponding E106G
4.8
MBP-E106G-H6
作为工具酶用于融合蛋白的亲和柱上酶切效率分析
通过对上述不同融合蛋白产量和酶活性综合分析，筛选出MBP-E106G-H6作为
融合蛋白亲和柱上酶切的工具酶，由于该融合蛋白N端带有MBP标签，可固定在麦
芽糖树脂上，同时C端带有His6标签，也可固定在Ni
2+
树脂上，因此MBP-E106G-H6
可以作为这两种柱的工具酶用于融合蛋白的亲和柱上酶切。本文尝试用
MBP-E106G-H6作为工具酶固定在Ni-NTA介质上用于4种带H6GST标签的融合蛋
21
白的亲和柱上酶切和固定在麦芽糖树脂上用于1种带MBP标签的融合蛋白的亲和柱
上酶切。
4.8.1 H6GST-tevS-mPrx融合蛋白的亲和柱上酶切
GST标签可以提高玉米2-半胱氨酸过氧化物还原酶A(maize 2-Cys peroxiredoxin
A，mPrx)的产量，但是研究该酶的结构时，应将标签切除。本研究将已构建好的质
粒pETGST-tevS-mPrx转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，扩大培养，28℃诱导12 h，细
胞破碎上清液过2 mL Ni-NTA介质纯化，将得到目的蛋白H6GST-tevS-mPrx按照比
例20:1加入蛋白酶MBP-E106G-H6，固定在Ni-NTA介质上，4℃酶切12 h后，用
Lysis Buffer洗脱下目的蛋白mPrx，最后用Elution Buffer洗脱下工具酶、标签及未被
切开的底物。利用12% SDS-PAGE电泳(图4-8 A)及His6抗体的蛋白印迹(图4-8 B)
分析检测柱上酶切效率，显示融合底物基本被完全被切开，获得纯度较高的目的蛋白。
图4-8 H6GST-tevS-mPrx融合蛋白的亲和柱上酶切
Fig. 4-8 On-resin cleavage of H6GST-tevS-mPrx fusion protein
(A)：SDS-PAGE分析柱上酶切过程(M：蛋白Mark；1：纯化的融合蛋白；2：柱上洗脱下的目的条带；3：酶切
后结合在柱上的蛋白)；(B)：His6抗体的蛋白印迹分析
(A)：SDS-PAGE analysis of on-column processing(M：Protein Mark；1：the purified fusion protein；2：the released target
protein from the affinity resin；3：the retained protein on the resin after cleavage)；(B)：Western blot analysis using
His6-tag antibody
4.8.2 H6GST-tevS-sDAL融合蛋白的亲和柱上酶切
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)2,3-二氨基丙氨脱氨酶(sDAL)的N端
含有组氨酸标签会影响sDAL的酶活及表达，为了提高sDAL蛋白表达量，构建了
pETGST-tevS-sDAL，N端的H6GST明显提高了sDAL的表达，但是H6GST影响eDAL
的活性，纯化后去除融合标签H6GST，sDAL的活性明显增高。因此本文用
MBP-E106G-H6切除融合标签H6GST，首先我们把纯化的融合蛋白GST-tevS-sDAL
按20:1的比例加入纯化工具酶MBP-E106G-H6，固定在Ni-NTA介质上，4℃酶切12
h后，用Lysis Buffer洗脱下目的蛋白sDAL，最后用Elution Buffer洗脱下工具酶、
标签及未被切开的底物。利用12% SDS-PAGE(图4-9 A)及His6抗体的蛋白印迹(图
22
4-9 B)分析检测柱上酶切效率，显示融合底物基本上完全被切开，并且获得纯度较高
的目的蛋白。
图4-9 H6GST-tevS-sDAL融合蛋白的亲和柱上酶切
Fig. 4-9 On-resin cleavage of H6GST-tevS-sDAL fusion protein
(A)：SDS-PAGE分析柱上酶切过程(M：蛋白Mark；1：纯化的融合蛋白；2：柱上洗脱下的目的条带；3：酶切
后结合在柱上的蛋白)；(B)：His6抗体的蛋白印记分析
(A)：SDS-PAGE analysis of on-column processing(M：Protein Mark； 1：the purified fusion protein；2： the released
target protein from the affinity resin；3：the retained protein on the resin after cleavage)；(B)：Western blot analysis using
His6-tag antibody
4.8.3 H6MBP-tevS-eDAL融合蛋白的亲和柱上酶切
大肠杆菌(Escherichia coli)2,3-二氨基丙氨脱氨酶(eDAL)N端含有组氨酸标签会
影响eDAL的活性及表达量，为了提高eDAL蛋白水溶性,构建了
pETMBP-tevS-eDAL，虽然MBP标签提高了eDAL的水溶性，但是MBP影响了目的
蛋白的活性，本文把构建好的质粒pETMBP-tevS-eDAL转化到大肠杆菌BL21（DE3）
中，扩大培养，28℃诱导12 h，细胞破碎上清液过2 mL Ni-NTA介质纯化,将得到目
的蛋白MBP-tevS-eDAL按照比例20:1加入蛋白酶MBP-E106G-H6,固定在麦芽糖树
脂上，4℃酶切12 h后，用再用洗柱液(200 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，1 mM DTT，
1 mM PMSF，pH 7.5)洗脱下来目的蛋白eDAL，最后用洗脱液(200
1 mM EDTA-Na
2
，
mM NaCl，20 mM Tris-HCl，1 mM DTT，1 mM EDTA-Na
2
，1 mM PMSF，10 mM
maltose，pH 7.5)洗脱下工具酶、标签及未被切开的底物。12% SDS-PAGE电泳(图4-10
A)及His6抗体做蛋白印迹(图4-10 B)分析检测柱上酶切效率，显示融合底物基本上
完全被切开，并且获得纯度较高的目的蛋白。
23
图4-10 H6MBP-tevS-sDAL融合蛋白的亲和柱上酶切
Fig. 4-10 On-resin cleavage of H6MBP-tevS-sDAL fusion proteins
(A)：SDS-PAGE分析柱上酶切过程(M：蛋白Mark；1：纯化的融合蛋白；2：柱上洗脱下的目的条带；3：酶切
后结合在柱上的蛋白)；(B)：His6蛋白印记分析
(A)：SDS-PAGE analysis of on-column processing(M：Protein Mark；1：the purified fusion protein；2：the released target
protein from the affinity resin；3：the retained protein on the resin after cleavage)；(B)：Western blot analysis using
His6-tag antibody
4.8.4 H6GST-tevS-mSrx融合蛋白的亲和柱上酶切
成熟玉米硫过氧化物还原蛋白(maize sulfiredoxin, mSrx)基因已从玉米基因组中
克隆出来
[108]
，本文将构建好的H6-Srx和H6GST-tevS-mSrx转化到大肠杆菌
BL21(DE3）中，28℃，0.5 mM IPTG诱导12 h，利用12% SDS-PAGE电泳检测，显
示H6-Srx融合蛋白水溶性极低，而在Srx的N端融合H6GST后水溶性明显提高(图
4-11 A)。将质粒pETGST-tevS-mSrx转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，扩大培养，28℃
诱导12 h,细胞破碎上清液过2 mL Ni-NTA介质纯化,将得到的目的蛋白
GST-tevS-mSrx按照比例20:1加入蛋白酶MBP-E106G-H6，固定在Ni-NTA介质上，
4℃酶切12 h后，用Lysis Buffer洗脱并没有蛋白洗脱掉，用20 mM或40 mM咪唑的
Wash Buffer也没有洗脱下来目的蛋白(图4-11 B)，我们尝试着在含20 mM咪唑的
Wash Buffer中，把NaCl的终浓度提高到1 M，12% SDS-PAGE电泳检测显示，被酶
切掉的目的蛋白完全被洗脱掉(图4-12 A)，His6抗体的蛋白印记表明得到纯度较高
的目的蛋白，并且融合蛋白酶底物也基本被完全切开(图4-12 B)。
24
图4-11 mSrx在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达及其柱上酶切检测
Fig. 4-11 Expression of mSrx in E. coli BL21(DE3) and detection of on-resin cleavage of mSrx
(A)：SDS-PAGE分析H6-mSrx和H6GST-tevS-mSrx在大肠杆菌BL(DE3)中的表达(1：H6-Srx；2：
H6GST-tevS-mSrx；U：未诱导；I：诱导)；(B)：SDS-PAGE分析柱上酶切过程（1：纯化的融合蛋白；2-4：分别
为含20 mM、40 mM和250 mM咪唑的Lysis Buffer洗脱掉的蛋白)
(A)：SDS-PAGE analysis of expression of His6-tagged mSrx and H6GST-tevS-mSrx in BL21(DE3)(1：
His6-tagged mSrx；2：H6GST-tevS-mSrx；U：uninduced；I：Induced)；(B)：SDS-PAGE analysis of on-column
processing(1：purified fusion proteins；2-4：eluted proteins with Lysis buffer；20 mM 、40 mM and 250 mM imidazole
in Lysis Buffer respectively)
图4-12 H6GST-tevS-mSrx融合蛋白的亲和柱上酶切
Fig. 4-12 On-resin cleavage of H6GST-tevS-mSrx fusion protein
(A)：SDS-PAGE分析柱上酶切过程(M：蛋白Mark；1：纯化的融合蛋白；2：柱上洗脱下的目的条带；3：酶切
后结合在柱上的蛋白)；(B)：His6抗体的蛋白印记分析
(A)：SDS-PAGE analysis of on-column processing(M：Protein Mark；1：the purified fusion protein；2：the released target
protein from the affinity resin；3：the retained protein on the resin after cleavage)；(B)：Western blot analysis using
His6-tag antibody
4.8.5 H6GST-tevS-mSR融合蛋白的亲和柱上酶切
已有报道玉米的D-丝氨酸消旋酶(maize D-serine racemase，mSR)蛋白的N端只
含有组氨酸标签时，融合蛋白的表示量极低，在N端加入H6GST标签可极大的提高
目的蛋白的表达量，但是H6GST影响mSR的晶体生长，因此应该去掉融合标签
25
H6GST，把构建好的质粒pETGST-tevS-mSR转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，扩大
培养，28℃诱导12 h，细胞破碎上清液过2 mL Ni-NTA介质纯化，将得到目的蛋白
H6GST-tevS-mSR按照比例20:1加入纯化的蛋白MBP-E106G-H6，固定在Ni-NTA介
质上，4℃ 酶切12 h后，先用Lysis Buffer洗脱掉目的蛋白mSR，再用Elution Buffer
洗脱结合在麦芽糖树脂上的蛋白，利用12% SDS-PAGE电泳显示融合蛋白底物
H6GST-tevS-mSR在柱上基本没有被切开(图4-13 A)，把上述蛋白混合反应液4℃液
相酶切12 h后，12% SDS-PAGE电泳分析液相酶切效率，显示融合蛋白
H6GST-tevS-mSR几乎能完全被切开(图4-13 B)，说明H6GST-tevS-mSR融合蛋白柱
上酶切存在空间位阻，影响了底物与酶的相互作用。
图4-13 从融合蛋白上裂解的mSR的检测
Fig. 4-13 Detection of the cleaved fusion protein for mSR
(A)：SDS-PAGE分析柱上酶切过程(M：蛋白Mark；1：纯化的融合蛋白；2：柱上洗脱下的目的条带；3：酶切
后结合在柱上的蛋白)；(B)：SDS-PAGE检测液相酶切(1：纯化的mSR融合蛋白；2：液相酶切)
(A)：SDS-PAGE analysis of on-column processing(M：Protein Mark；1：the purified fusion protein；2：the released target
protein from the affinity resin；3：the retained protein on the resin after cleavage)；(B)：Cleavage of the fusion protein in
the buffer detected by SDS-PAGE(1：purified mSR fusion；2：the cleavage in the free reaction buffer)
26
5 讨论
在本研究中，采用多种方法来提高TEV蛋白酶在大肠杆菌中功能性表达，首先，
在TEVp
5M
同义突变体基础上进行氨基酸定点突变，并分析了不同突变体的表达和活
性；其次，在优化得到的TEVp突变体N端分别融合不同的标签，在标签蛋白和TEVp
之间加入tevS，构建了TEV蛋白酶分子内自剪切融合蛋白，分析了不同标签对优化
TEVp的水溶性及活性的影响；再次分析稀有tRNA丰度对标签效应的影响；分析纯
化的TEVp的产量和活性；最后筛选出带双标签的TEVp作为工具酶用于融合蛋白的
亲和柱上酶切并检测了其酶切效果。
5.1 不同TEVp突变体水溶性及活性研究
野生型TEVp在大肠杆菌中表达的水溶性较低，为了提高该蛋白酶了水溶性，在
野生型突变体基础上进行S219N定点突变，发现突变体的水溶性和活性相对于野生
型都有所提高
[91]
。通过对野生型突变体筛选，得到一个双突变体(L56V/S135G)，不
仅提高了TEVp的水溶性，而且提高了TEVp的耐热性
[96]
。与突变体融合报告基因，
筛选出三突变体(T17S/N68D/I77V)，其产量比野生型蛋白酶提高了五倍之多
[97]
。
Lingling Wei在S219N的基础上同时进行了这五个位点的突变，并与野生型及三突变
的TEVp进行了比较，该蛋白的水溶性，表达量和活性都得到很大程的提高
[72]
。Jie
Fang 等人又在该突变体的基础上构建了TEVp
5M
同义密码子突变，分析得出该同义
密码子突变体蛋白水溶性得到提高，但是活性下降
[73]
。已有报道K45F或E106G可
以改善TEVp的折叠
[109]
，因此在TEVp
5M
基础上进行K45F或E106G突变或同时进
行K45F/E106G双突变来改善TEVp的折叠，通过对这3个不同TEVp突变体的分析，
只有E106G在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的水溶性有所提高，而K45F突变削弱了
TEVp的折叠，K45F/E106G突变进一步削弱了TEVp的折叠。这可能是TEVp
5M
同义
突变体上的五个氨基酸突变影响了K45F或K45F/E106G突变对TEVp的蛋白折叠。
5.2 不同标签对TEVp表达及活性影响研究
为了提高TEVp的水溶性，人们尝试将MBP与TEVp融合表示发现，融合蛋白
的表达量得到明显的提高
[94]
；将超折叠的绿色荧光蛋白（sfGFP）与TEVp融合表达
后也能提高融合蛋白的水溶性
[95]
；将TEVp与含有分子伴侣的两个载体共表达，在低
温诱导条件下，提高了TEVp的产量，并且活性得到保持。也有报道将特定的大肠杆
菌分子伴侣Dnak、GroEL、GroES与鼠蛋白融合表达，明显提高了目的蛋白的水溶
性
[52]
，但是大肠杆菌分子伴侣与TEVp融合表达未见报道，因此本研究也把特定的大
肠杆菌分子伴侣Dnak、GroEL和GroES与E106G融合表达。大肠杆菌中编码翻译起
始因子II的基因InfB(1-21)序列作为表达标签(expressivity tag，Ex-tag)与目的蛋白融
27
合后，明显提高了目的蛋白的水溶性
[51]
，为此本文也将InfB (1-21)序列融合在E106G
的N端。本文在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta
TM
(DE3)两个菌株中研究不同标签对
优化的突变体E106G表达及活性的影响。本研究在N端的标签与E106G之间加入了
tevS,构建表达分子内自剪切的融合蛋白酶，同时也构建了表达不含tevS的融合蛋白
Ex-E106G和MBP-E106G-H6。研究发现E106G通过自剪切作用从标签上可被完全释
放出来，从而我们可以研究从不同标签上释放出来的E106G和Ex-E106G的水溶性及
活性。在大肠杆菌BL21(DE3)中，Dnak、GroEL、GroES和MBP都提高了TEVp的
水溶性，首次发现GroES可以提高TEVp的水溶性，但只有GroEL和MBP提高了该
蛋白的活性，从而推测GroEL和MBP促进了蛋白的折叠，但是Ex-E106G在大肠杆
菌BL21(DE3)中的活性明显下降，可能是由于其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平
低的原因。
大肠杆菌Rosetta
TM
(DE3)除了提供大肠杆菌稀有的精氨酸密码AGA和AGG外，
还提供大肠杆菌比较偏少的亮氨酸的密码子CUA、异亮氨酸的密码子AUA、甘氨酸
的密码子GGA和脯氨酸的密码子CCC，这六种密码子也存在TEVp的编码序列中，
因此在大肠杆菌Rosetta
TM
(DE3)中研究稀有tRNA丰度对TEVp突变体水溶性及活性
影响。研究发现提高稀有tRNA丰度后，Ex-tag也有效的提高了E106G在破碎上清
中的表达同时也提高了TEVp的活性；MBP明显提高了E106G的表达但同时也显著
降低其活性，去掉tevS后，MBP并没有提高E106G在大肠杆菌两菌株中的水溶性，
但是提高了E106G在大肠杆菌Rosetta
TM
(DE3)菌株中的活性；GroEL在大肠杆菌
BL21(DE3)和Rosetta
TM
(DE3)两个菌株中都既提高了E106G在破碎上清中的产量也
有效的提高其活性，但是，纯化TEVp的产量越高，相对应的活性就越低，只有纯化
的MBP-E106G-H6融合蛋白产量高、活性也高。
综上所述，得出，一些融合蛋白标签对改善TEVp突变体的产量和质量受内源稀
有tRNA丰度影响，现有研究表明不同菌株中明晰标签效应很重要，即使有蛋白标签
的作用，纯化的TEVp不具备最优化的产量和质量。
5.3 TEV蛋白酶作为工具酶用于融合蛋白亲和柱上酶切研究
TEV蛋白酶常被用来切除融合标签，通常在液相中进行切除融合标签，多数情
况下还得利用亲和色谱进行分离目的蛋白，融合标签，未被完全切开的融合蛋白及工
具酶，液相酶切法步骤繁琐、反应时间长、且获得目的蛋白的效率低，此方法不易应
用于大规模获得目的蛋白。为了解决这一问题，把TEVp融合了Streptag-II，不仅使
得TEV蛋白的产量增加，还可以作为固定化酶，用于融合蛋白的亲和柱上酶切
[93]
。
本研究优化出的融合蛋白MBP-E106G-H6，由于N端融合MBP标签可固定在麦芽糖
树脂作为工具酶用于融合MBP标签的融合蛋白亲和柱上酶切，C端带有His6标签也
28
可固定在Ni-NTA介质上作为工具酶用于融合His6标签的融合蛋白亲和柱上酶切。
本文把融合蛋白MBP-E106G-H6工具酶，用于切除5种融合蛋白酶。研究发现，其
中3种融合蛋白(H6GST-tevS-sDAL、MBP-tevS-eDAL和H6GST-tevS-mPrx)在亲和柱
上4℃ 酶切12 h后，基本上能被完全切开，并且用Lysis Buffer一步洗脱就能获得纯
度较高目的蛋白。融合蛋白H6GST-tevS-mSrx在亲和柱上4℃酶切12 h后，基本上
能被完全切开，但是对目的蛋白的洗脱条件进行了三次摸索，才得到纯度较高的目的
蛋白。同时也发现在同样条件下，H6GST-tevS-mSR融合蛋白在柱上基本上没有被切
开，但是同样条件液相酶切，H6GST-tevS-mSR融合蛋白可被切开，说明
H6GST-tevS-mSR融合底物和酶在柱上存在着空间位阻，同时也表明不是所有的融合
蛋白都适合柱上酶切，甚至对某些目的蛋白的洗脱条件都需要摸索，因此固定化酶用
于融合蛋白亲和柱酶切也存在着一定的局限性。
29
结论
1.E106G突变能提高TEVp
5M
同义突变体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的水溶性和活
性
2.提高胞内稀有tRNA水平，不同标签对促进TEVp突变体水溶性表达效应均高于组
氨酸标签
3.在大肠杆菌表达系统中，我们首次证明GroES能提高TEVp突变体的水溶性
4.即使有蛋白标签的作用，纯化的TEVp不能同时具备最优化的产量和质量
5.标签的优化必须考虑到菌株的遗传背景
6.本文构建的TEVp突变体可有效用于特定蛋白的柱上酶切，但也存在着一定的局限
性
30
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