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2024年12月27日发(作者：vbasic 教程)

罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。

反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。

试剂盒组成：

小瓶/盖子

1 蓝色

标签

酶溶液

内容物

大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶，

在storage buffer中

10×conc.

5×50ul

2 紫色 标记溶液 在reaction buffer中的核苷酸混合物

1×conc.

5×550ul

3 黄色 转化-POD 抗荧光素抗体，绵羊Fab片段，连接有辣根过

氧化物酶

Ready-to-use

3.5ml

需要自己配置的其他物品：

除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。下表列出每步所需物品概览：

步骤

样品准备section 3.2

黏附细胞，细胞涂片和细

胞离心涂片准备

section3.2.1

冰冻组织section3.2.2.2

Washing buffer：磷酸缓冲液PBS*

Bloking buffer封闭缓冲液：溶于甲醇的3%H2O2

Fixation solution固定剂：溶于PBS的4%多聚甲醛，

ph7.4，新鲜配制

Permeabilisation solution渗透溶液：溶于0.1%柠檬酸钠的

0.1%Triton X-100，新鲜配制（6）

固定剂

石蜡包埋组织 二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸

水中）

Washing buffer：PBS*

蛋白酶K*，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于

10mM Tris/HCL中，ph7.4-8]

替代处理方案

※渗透溶液：（0.1%Triton

1

） X-100，溶于0.1%柠檬酸钠

的，新鲜配制

※胃蛋白酶*（0.25%-0.5%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白

酶*，0.01N HCL，不含核酸酶

※0.1M柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射

标记步骤 section3.3

阳性对照 section3.3.1

黏附细胞，细胞涂片和细

section3.3.2

Parafilm石蜡封

湿盒

微球菌核酸酶或

DNase I，重组，级别1*

Washing buffer：PBS*

胞离心涂片和组织 口膜或盖片

section3.2.2.1

设备 试剂

Difficult tissue 困难组织 塑料容器

微波

湿盒

Citrate buffer柠檬酸盐缓冲液，0.1M，ph6.0

Washing buffer：PBS*

Tris-HCL，0.1M ph7.5，含3%的BSA*和20%正常牛血清

Washing buffer：PBS*

DAB Metal Enhanced Substrate Set*DAB金属增强底物*或

POD底物替代物

光镜镜检封固剂

信号转换 section3.4

湿盒

Parafilm石蜡封

口膜或盖片

产品概述：

特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生

长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂

实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。空间位阻，如细胞外

元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。两种情况均能产生假阴性。

假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段

DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。两种情况均能产生假阳性。

为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查

凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，细胞形

态评估是一项重要的参数

样本：细胞离心涂片和细胞涂片

在chamber slides上培养的黏附细胞

冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本

分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透

检测次数：一个试剂盒50T

试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可稳定至标签上标明的效期。

试剂

TUNEL反应混合物

转化-POD

储存和稳定性

TUNEL反应混合物应在用前临时配制，不能储存

TUNEL反应混合物用前应置于冰上

一旦融化转化-POD溶液后，应储存于2-8℃（最长稳定6个月）

注意：禁止冰冻结冰

优点：

优点

灵敏

特异

快速

简便

灵活

Function-tested功能检查

特点

在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断

对坏死来说，优先标记凋亡

分析时间短（2-3h）

试剂稳定、优化，没有稀释步骤

适合于固定细胞核组织，允许堆积、贮存和转运样本

双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段

对于大量的批号来说，每一批号均进行了功能检测

步骤和所需材料：

1 流程图：

2 样品准备

2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片

需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS）

Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2

Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制

Permeabilisation solution 渗透液：0.1%Triton

1

X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，

）

新鲜配制

步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。

注意：固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照

步骤 操作

1

2

3

4

5

6

用新鲜配制的固定液固定风干的细胞样本，1h，15-25℃

用PBS冲洗玻片

用封闭液孵育，10min，15-25℃

用PBS冲洗玻片

用渗透液孵育，2min，置于冰上2-8℃

按3.3操作

2.2 组织部分

2.2.1 福尔马林-包埋组织

福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。如用蛋白酶K，不含核酸酶，浓度、孵育

时间和温度应按组织类型优化

注意：只用罗氏应用科学的蛋白酶K，因其经检测不含核酸酶，核酸

酶可导致假阳性。

另外3中替代方法在下表中描述（step 2）

需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中）

Washing buffer：PBS

蛋白酶K，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于10mM Tris/HCL中，

ph7.4-8]

替代处理方案

※渗透溶液：0.1%Triton

1

X-100，溶于0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制

）

※胃蛋白酶*（0.25%-0.5%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋白酶*，0.01N HCL，不

含核酸酶

※0.1M柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射

步骤：下表描述了用蛋白酶K（不含核酸酶）和3中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的方法

注意：加入额外的组织用于阴性和阳性对照

步骤

1

2

操作

按照标准操作脱蜡和再水化组织（e.g. 60℃加热，二甲苯浸洗，一系列梯度酒精和双蒸

水再水化

用蛋白酶K工作液于21-37℃中孵育15-30min

替代方法

1.渗透液

2. 胃蛋白酶或胰蛋白酶

3.微波射线

孵育8 min

37℃孵育15-60min

将玻片置于含有200ml 0.1 M柠檬酸盐缓冲液，ph6.0的

塑料容器中

350 W微波放射 5 min

操作

3

4

用PBS冲洗两次

按3.3操作

2.2.2 冰冻组织处理（略）

3 标记草案

3.1 开始之前

准备TUNEL反应混合液：每一对管子（小瓶1：酶溶液，小瓶2：标记溶液）足以用于50ul反应体

系的10张片子，和2个50ul标记溶液的阴性对照。

注意：TUNEL反应混合液应于用前临时配制，不能储存。TUNEL反应混

合液用前置于冰上

步骤

1

2

3

操作

取100ul标记溶液（小瓶2）用于阴性对照

加入总量50ul的酶溶液（小瓶1）于450ul的标记溶液中，以获得500 ul TUNEL反应

混合液

充分混匀

DNase I，重组，级别1*

对照：每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应

阴性对照

阳性对照

孵育固定和渗透的细胞于50ul/标记溶液中（无末端转移酶），替代用TUNEL反应

混合液孵育

孵育固定和渗透的细胞于微球菌核酸酶或DNase I，重组，级别1中

（3000U/ml-3U/ml 于50mM Tris-HCL中，ph7.5，10mM MgCL2，1mg/ml BSA）

10min，15-25℃，以诱导在标记前DNA链断裂

3.2 黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案

需准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS

湿盒

Parafilm石蜡封口膜或盖片

步骤：参考下表

步骤

1

2

3

操作

用PBS冲洗两次

使样品周围区域变干

加入50ul TUNEL反应混合液于样品上

注意：阴性对照加入50ul标记溶液。确保TUNEL反应混合液均匀分布于单层细胞

上，避免蒸发丢失。孵育时样品上应覆盖Parafilm石蜡封口膜或盖片

4

5

6

在湿盒、暗室中加盖孵育60min，37℃

用PBS冲洗3次

可在样品上加入1滴PBS，于荧光显微镜下观察。激发光波长450-500 nm，在515-565

nm（绿色）范围类检测

3.3 困难组织标记草案（略）

3.4 信号转换

需要准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS

湿盒

Parafilm石蜡封口膜或盖片

DABA底物或POD替代底物

光镜镜检封固剂

步骤：按照下表操作

步骤

1

2

操作

使样品周围区域变干

加入50 ul 转化-POD（小瓶3）于样品上

注意：确保转化-POD溶液均匀分布于单层细胞上，避免蒸发丢失。孵育时样品

上应覆盖Parafilm石蜡封口膜或盖片

3

4

5

6

在湿盒中孵育30min，37℃

用PBS冲洗3次

加入50-100ul DAB底物或POD替代底物

于15-25℃孵育10min

需准备的其他试剂：微球菌核酸酶或

7

8

用PBS冲洗3次

用玻璃盖片封固（e.g. 用PBS/甘油），光镜下检查

替代方法：光镜检查前可复染

4. 附件：

4.1 Troubleshooting

问题 步骤/试剂

非特

异性

标记

固定

包埋组织

可能原因

紫外辐射用于包埋组织的聚合

（e.g.异丁烯酸盐导致DNA链

断裂）

酸性固定剂（e.g. 甲安菲他明，

Carnoy’s

固定剂）

TUNEL反应

转化步骤

TdT浓度太高

内源性POD活性

抗-银光素-POD非特异性连接

用TUNEL 稀释缓冲液1:2至1:10 稀

释TdT浓度

细胞渗透前，浸入3% H2O2甲醇稀

释液10min，封闭内源性POD

用正常抗绵羊血清封闭

用含3% BSA的PBS封闭20min

减少转化溶液浓度50%

核酸酶 某些组织（e.g. 平滑肌，组织准

备后很快出现DNA断裂）

某些酶仍有活性

背景

高

TUNEL反应

转化步骤

固定 福尔马林固定导致含有黑色素

前体的细胞黄染

对于乳腺癌，标记混合物浓度

太高

内源性POD活性

抗-银光素-POD非特异性连接

取得器官后立即固定组织

通过肝静脉灌注固定剂

用含有ddUTP和dATP的溶液封闭

使用甲醇固定，但同时应考虑甲醇固

定可能降低灵敏度

用TUNEL稀释缓冲液使标记混合物

浓度降低50%

细胞渗透前，浸入3% H2O2甲醇稀

释液10min，封闭内源性POD

用正常抗绵羊血清封闭

用含3% BSA的PBS封闭20min

减少转化溶液浓度50%

样品

支原体污染

高增殖细胞

支原体检测试剂盒

双染，e.g.用Annexin-V-Fluos

注意：Measuring via microplate

reader not possible because of too high

background.

使用4%多聚甲醛

使用福尔马林或戊二醛

建议

使用不同的包埋材料或不用的聚合试

剂


本文标签： 细胞 组织 溶液 标记 凋亡

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