NAMPT抑制剂协同NQO1底物在治疗人非小细胞肺癌中的应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.3

(22)申请日 2014.05.23

(71)申请人 中国药科大学

地址 211198 江苏省南京市龙眠大道639号中国药科大学

(72)发明人 王广基 郝海平 刘慧颖 李清然 程学芳

(74)专利代理机构

代理人

(51)

A61K45/06

A61K31/58

A61K31/352

A61K31/4545

A61P35/00

(10)申请公布号 CN 103961711 A

(43)申请公布日 2014.08.06

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

NAMPT抑制剂协同NQO1底物在

治疗人非小细胞肺癌中的应用

(57)摘要

本发明涉及一种联合用药物，它包

括一定量的NAMPT抑制剂以及一定量的

NQO1底物，它们在抗肿瘤过程中具有协

同作用，其中所述NAMPT抑制剂和所述

NQO1底物的联合使用使得该组合物的作

用优于每种药物单独使用时的加和作用。

可以将这种联合用药物用于治疗人非小细

胞肺癌及其他癌症。有此本发明提供了治

疗人非小细胞肺癌的新型治疗方法。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种联合用药物,包括NAMPT抑制剂及NQO1底物且任选地可以包括一种或多

种可药用载体。

2.权利要求1所述的联合用药物,其特征在于该联合用药物包括含有NAMPT抑制剂

和NQO1底物以及任选的联合一种或多种可药用载体的药物组合物。

抑制剂和NQO1底物在制备具有抗肿瘤作用药物的用途。

抑制剂在制备用于与NQO1底物一起给药的用于治疗非小细胞肺癌或其

他癌症的用途。

1底物在制备用于与NAMPT抑制剂一起给药的用于治疗非小细胞肺癌或其

他癌症的用途。

6.一种用于治疗非小细胞肺癌的方法,该方法包括使用有效量的NQO1底物与

NAD+合成抑制剂联合用药物治疗。

说 明 书

技术领域

本发明涉及天然药物领域及制药领域,具体涉及NAMPT抑制剂与NQO1底物联合

制备治疗肿瘤的药物的用途。更具体的,涉及NAMPT抑制剂与NQO1底物协同治

疗非小细胞肺癌的用途。

背景技术

非小细胞肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,在由肿瘤引起的死亡原因中排第

一位。目前尚无有效低毒的治疗方法。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nicotinamideadeninedinucleotide缩写NAD+。可在氧化还原

过程中从底物中接受一个氢原子和一个电子,变成还原型,在呼吸链的电子传递过程

中起到核心枢纽作用。近年来NAD+在维持细胞代谢活性、细胞应激抵抗和寿命延

长等方面的作用也得到了广泛研究。例如,NAD+可作为ADP-核糖基供体参与DNA

修复酶PARP的活化过程,进而影响DNA损伤应答;也可做为去乙酰化酶SIRT1发

挥活性必须的辅酶参与转录调控、应激抵抗及细胞分化等过程。细胞内NAD+水平

的调控对决定细胞命运起重要作用。NAD+合成分为从头合成和补救合成两条通路,

其中补救合成途径是细胞内NAD+的主要来源。烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)

控制着NAD+补救合成通路中尼克酰胺(NAM)向NAD+的转化,为补救合成限速酶。

基于通过NAD+缺失发挥抗癌作用的NAMPT抑制剂已有部分进入临床试验。

CN103347860A公开了抑制NAMPT活性的化合物、含有该化合物的组合物和治疗

疾病期间表达NAMPT的疾病的方法。CN103384668A公开了用于抑制NAMPT的

化合物和组合物及其合成、应用和解毒剂。FK866为最早发现的NAMPT有效抑制

剂,抑制常数K

i

为nmol级别。Tie-qiangBiandXiang-mingChe等试验表明,FK866在非肿瘤细胞中毒

性较小,可抑制多种肿瘤细胞生长,且无明显副作用。

丹参酮IIA与β-拉帕醌为NQO1靶向药物,经由NQO1代谢并发挥抗肿瘤作用。

丹参酮IIA结构式为:

分子式为C

19

H

18

O

3

。

β-拉帕醌结构式为:

分子式为C

15

H

16

O

3

。

CN1264580公开了丹参酮在制备治疗肿瘤药物中的新用途,动物体内实验和临床试

验表明丹参酮具有杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞分化和诱导肿瘤细胞凋亡的良好效

果,且毒副作用小,具有良好的应用前景。CN103006669A公开了丹参酮IIA介导

FOXO1依赖途径抗肿瘤的机制,主要涉及丹参酮IIA通过FOXO1依赖途径诱导人

非小细胞肺癌细胞株A549的细胞凋亡作用。HuangX等人于2012年共开了A549

细胞中β-拉帕醌NQO1依赖性引发NAD+下调并诱导肿瘤细胞凋亡的特性

(HuangX,DongY,BeyEA,KilgoreJA,BairJS,1substratewithpotentantitumor

activitythatselectivelykillsbyPARP1-

Res.2012Jun15;72(12):3038-47.)

发明内容

本发明的目的是提供安全有效的肿瘤治疗的联合用药方法,采用NAMPT抑制剂与

NQO1底物联合用药物,以达到协同起效的作用。

本发明所采用的NQO1底物包括丹参酮IIA及β-拉帕醌。NAMPT抑制剂是指能够

抑制NAMPT活性、阻断NAD+生成的物质或药物。本发明所选用的NAMPT抑制

剂是FK866。发明中阐释了NAMPT抑制剂与NQO1底物在诱导人非小细胞肺癌

细胞凋亡过程中具有协同作用。MTT实验结果显示,NAMPT抑制剂FK866可加重

NQO1底物丹参酮IIA及β-拉帕醌对A549细胞的细胞毒作用。LC-MS

n

检测给药后NAD

+

水平,发现FK866共同作用可显著加剧丹参酮IIA及β-拉帕醌引起的NAD

+

水平降低。SIRT1活性检测实验结果表明,FK866可加重丹参酮IIA及β-拉帕醌对

SIRT1活性的抑制。WesternBlot实验结果显示FK866可增强丹参酮IIA及β-拉帕

醌诱导的Ac-FOXO1激活和PARP1活化,加剧对SIRT1蛋白的抑制。

附图说明

图1:丹参酮IIA及β-拉帕醌时间依赖性上调NAD

+

补救途径合成酶NAMPT表达

图2:A,FK866增加丹参酮IIA对A549细胞的细胞毒作用;B,FK866增加β-拉帕醌对

A549细胞的细胞毒作用

图3:FK866可加重丹参酮IIA及β-拉帕醌引起的NAD

+

水平降低

图4:FK866可加重丹参酮IIA及β-拉帕醌对SIRT1活性的抑制

图5:FK866可增强丹参酮IIA及β-拉帕醌诱导的Ac-FOXO1激活和PARP1活化,加

剧二者对SIRT1蛋白的抑制。

具体实施方式

以下几个实施例,通过机制阐述本发明的抗肿瘤用途,但并不表示实施例对本发明的

限制。

实施例实验

实验材料:

人非小细胞肺癌细胞A549细胞购自ATCC,于37°C,5%CO

2

条件下常规培养,培养基为含10%小牛血清(PAA)的RPMI-1640(Gibco);胎牛血清

(Fetalbovineserum)购于Hyclone(Logan,Utah,USA);胰蛋白酶(Trypsin)购于

Amersco(Solon,Ohio,USA);青霉素、链霉素、二甲基硫代二苯基四噻唑(MTT)、

GAPDH抗体均购于南京生兴生物工程公司(江苏);Trizol总RNA提取试剂、RT-

PCR试剂盒、Real-timePCRMasterMix(SYBRGreen)购自Takara(大连宝生物)。

实验方法:

A549细胞接种于6孔板,给药丹参酮IIA40μM,或β-拉帕醌20μM(2h撤药)处理时间

分别为0h,2h,4h,8h,12h,24h;。每1×10

6

细胞中,加入1mLTrizol,用1mL移液枪吹至液体澄清且无细胞团块并转移入

1.5mLEP管中,按照Takara总RNA提取试剂盒操作提取总RNA,并进行RNA定量。

按照RT-PCR试剂盒将mRNA逆转录为cDNA,按照

ThermalCyclerDiceTMRealTimeSystem(TaKaRaCode:TPS00)使用说明书要求进行

PCR试验操作。定量PCR反应条件:

Stage1:预变性:95°C,30sec

Stage2:PCR反应:95°C,5sec;Tm,15sec;72°C,30sec;45Cycles

Stage3:融解曲线分析:95°C15sec;70°C15sec。

采用Livak法半定量分析RT-PCR检测结果。

实施例实验

A549细胞接种于96孔板,培养生长至80%满,给予FK86610nM,1小时后给予不同浓

度丹参酮IIA(0、0.4、1、2、4、10、20、40μM)处理72h;或β-拉帕醌(0、1.25、2.5、

5、10、20μM)处理2h后更换无药培养基培养至24h。更换无血清培养基并每孔中

加入20μL(5mg/mL)MTT,置二氧化碳培养箱中温孵4h后去除MTT溶液,加入

DMSO150μL溶解结晶(37°C摇床,50r/min),10min后取出置于酶标仪(测定波长

570nm,参比波长630nm)中测定其吸光度。给药组细胞存活率用以下公式计算:

存活率=处理组吸光度/对照组吸光度*100%

实施例-MS

n

检测细胞内NAD

+

水平

A549细胞接种至6孔板,培养生长至80%满,给予FK86610nM,1小时后给予40μM

丹参酮IIA处理48小时;或20μMβ-拉帕醌处理24h。弃掉培养基,生理盐水荡洗细

胞,每孔加入1ml80%含50ng/ml2-氯腺苷(内标)甲醇,-80°C放置20分钟,冰浴将细胞

刮下并转入EP管,超声破碎,14000rpm离心5分钟,上清转入新EP管中,挥干,100μl

超纯水复溶进样。

色谱条件:色谱柱为酰胺柱(3x100mmi.d.,5μm,Chrom-MatrixInc),柱温40°C。流动相:

水相(A)为含5mM醋酸铵的水溶液,有机相(B)为甲醇,柱温为40°C,流速为

0.2mL/min,采用梯度洗脱方式进行色谱分离,梯度设置如下:0.50-2.5min80%(B),2.5-

4min80%-30%(B),4-6.5min30%(B),6.5-7.5min30-80%(B),7.5-15.0min80%(B);进样体

积为10μL。

质谱条件:用电喷雾离子源(ESI),设定源参数分别为:喷雾电压

(IonSprayVoltage/IS)4500V,辅助气1(IonSourceGas1/GS1,N2)12Arb,辅助气

2(IonSourceGas2/GS2,N2)50Arb,辅助气加热温度(Temperature/TEM)500°C,气帘气

(CurtainGas/CUR)30Arb,碰撞气(CollisionGas/CAD,N2)4Pa。选用正离子模式

(Positive)下多重离子反应监测(MRM),设定Q0入口电压(EntrancePotential/EP)为

10V,Q2出口电压(CollisionCellExitPotential/CXP)为15V。NAD+的MRM参数为:母

离子(Q1Mass)为664.300Da,子离子(Q3Mass)为136.300Da,去簇电压

(DeclusteringPotential/DP)为95V,碰撞电压(CollisionEnergy/CE)为60eV。NADH的

MRM参数为:母离子(Q1Mass)为666.300Da,子离子(Q3Mass)为649.200Da,去簇电压

(DeclusteringPotential/DP)为93V,碰撞电压(CollisionEnergy/CE)为23eV。内标(IS)的

MRM参数为:母离子(Q1Mass)为302.200Da,子离子(Q3Mass)为169.900Da,去簇电压

(DeclusteringPotential/DP)为70V,碰撞电压(CollisionEnergy/CE)为25eV。

NAD+,NADH出峰时间为3.23min,内标出峰时间为3.41min。

实施例1活性检测

SIRT1活性检测根据荧光SIRT1检测试剂盒(SigmaCS1040)说明进行试验。

细胞经裂解液提取,超声破碎,离心取上清20μL加入黑边透明底96孔板,与10μL荧

光SIRT1底物及5μLNAD

+

溶液混匀,室温孵育30分钟。加入5μL显色液孵育10分钟。荧光酶标仪读取激发

波长340nm、发射波长430nm的荧光吸光度值。

以试剂盒中荧光标准品配制横坐标为荧光底物浓度、纵坐标为吸光度值的标准曲线,

实验组数值以对对照组百分数表示。

实施例nBlot实验

A549细胞接种于6孔板,培养生长至80%满,给予FK86610nM,1小时后给予40μM

丹参酮IIA处理48小时;或20μMβ-拉帕醌处理24h。PBS洗涤细胞一次后,置于冰

板上,用细胞刮子将细胞刮下收集,8000rpm×1min离心得到细胞沉淀,每20μL细胞压

积中加入100μLRIPA细胞裂解液,冰上裂解30min后,超声破碎5次,每次

2s,15000rpm×10min离心得到上清即为提取到的总蛋白样品。BCA法测定蛋白含量。

蛋白样品按体积比3∶1加入上样缓冲液并煮沸5min。制备8%SDS-PAGE,对样品

进行电泳分离。电泳分离后,进行湿电转移,将蛋白转至PVDF膜。PVDF膜在含5%

脱脂奶粉的TBST溶液中封闭1h后,4°C孵育一抗过夜,相应二抗室温孵育1h,ECL

显影,Bio-Rad凝胶成像仪成像。