黄淮麦区部分小麦品种(系)高分子量麦谷蛋白亚基的SDS-PAGE和分子标记分

黄淮麦区部分小麦品种(系)高分子量麦谷蛋白亚基的SDS-PAGE和分子标记分析

王静;刘东涛;陈荣振;冯国华;张会云;马红勃

【摘 要】利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和分子标记技术,对黄淮麦区47份小麦育种材料高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)进行鉴定和分析.SDS-PAGE结果表明,在所检测的小麦品种(系)中,Glu-A1位点编码的HMW-GS有3种类型,分别是Null、1和2*,其中1出现频率较高(80.9％),Null次之(17.0％),2*仅有1份;Glu-B1位点有7+8、7+9、17+18共3种类型,其中7+8和7+9出现频率较高,分别为48.9％和44.7％;Glu-D1位点有2+12、5+10、4+12共3种类型,其中5+10出现频率最高(61.7％).利用Dx5 、Ax2*、By8、By9和y17亚基特异性分子标记检测结果表明,参试材料中含各标记亚基的材料依次为29(61.7％)、1(2.1％)、23(48.9％)、21(44.7％)、3(6.4％)份;在所检测的小麦品种(系)中含最优亚基组合Dx5、By8的材料共13份,频率为27.7％.分子标记检测结果与SDS-PAGE检测结果相吻合,表明亚基特异性分子标记可用来快速检测小麦材料中的HMW-GS基因.

【期刊名称】《西北农业学报》

【年(卷),期】2015(024)002

【总页数】6页(P27-32)

【关键词】小麦;高分子量麦谷蛋白亚基;分子标记;SDS-PAGE

【作 者】王静;刘东涛;陈荣振;冯国华;张会云;马红勃

【作者单位】江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州 221121;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州 221121;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州 221121;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州 221121;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州 221121;江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州

221121

【正文语种】中 文

【中图分类】S512.1;S331

小麦品质育种自20世纪90年代以来在中国发展迅速，而小麦的加工品质倍受育种家们关注。在影响小麦加工品质的众多因素中，高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的遗传组成与加工品质有密切关系，HMW-GS 组成已成为品质育种中亲本选配和杂交后代选择的重要依据。高分子量麦谷蛋白由位于第1部分同源群染色体1A、lB和1D长臂上的 Glu-1基因位点所编码，分别称为 Glu-A1， Glu-B1，

Glu-D1，到目前为止，已经发现并命名的亚基超过40种[1]。HMW-GS的 Glu-1位点存在广泛的等位基因变异， Glu-A1位点有5种等位基因，编码6种亚基，其中Null、1和2*较为常见； Glu-B1位点有16种等位基因，编码18种亚基，其中7+8、7+9、17+18、20、13+16、14+15等较为常见； Glu-D1位点有18种等位基因，编码26种亚基，其中2+12和5+10较为常见[2-3]。当然还会不断有新亚基被发现。虽然每个普通小麦基因组中均有6个高分子量麦谷蛋白基因，但由于部分基因沉默或不表达，因此普通小麦一般只表达3～5个HMW-GS基因，其中1Bx、1Dx和1Dy通常都表达，1Ax和1By在部分品种中表达，而1Ay基因通常不表达[4-7]。研究表明，不同HMW-GS对加工品质的影响不同，

Glu-A1位点上2*亚基与较好面包的烘烤品质相关； Glu-B1位点上14+15亚基

与蛋白质含量、面包体积正相关； Glu-D1位点上5+10亚基与面团的弹性、稳定时间正相关； Glu-A1位点上的Null亚基、 Glu-B1位点上的6+8、7+9亚基、

Glu-D1位点上的2+12亚基通常与较劣质面包的烘烤品质相关[8-11]。准确鉴定育种亲本的高分子量谷蛋白亚基基因组成，是通过蛋白标记有计划地聚合特定亚基基因，是选育专用小麦新品种的基础。

编码HMW-GS的基因具有高度的同源性，不同等位基因间DNA序列大小的差异主要是由于基因中部重复序列大小及重复次数不同引起的，变异主要是由该区域内DNA序列重复和缺失所造成的[12]。据此，国内外学者设计出能特异扩增HMW-GS基因的中部重复序列保守性引物，用1对引物经1次PCR反应可以完成不同材料的多个HMW-GS基因的分子标记，根据扩增片段的大小可以准确鉴定该基因的类型及是否为新基因[13-14]。D’Ovidio等[15]根据已经报道的高分子量谷蛋白基因核酸序列设计一些 Glu-1位点基因的特异性引物。高分子量谷蛋白基因的N-末端和C-末端序列非常相似，只有几个核苷酸发生改变，而序列两端区域的1个或2个核苷酸的差异就能够对HMW-GS的Y-型基因和X-型基因进行特异性扩增。目前已经开发出HMW-GS的1、2*、Null、5、10、2、12、7、8、9、16、18等功能分子标记，这些标记已应用于HMW-GS的鉴定[16]。本研究采用SDS-PAGE和分子标记2种方法同时对黄淮麦区47份小麦育种亲本材料HMW-GS进行分离和鉴定，以期为小麦品质遗传改良中亲本选配提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

47份小麦种质材料为黄淮麦区骨干育种亲本及优质亲本材料，其中2份国外引进品种。所有材料在徐州地区均能正常生长发育。HMW-GS组成分析中均以烟农19和中优9507为对照(表1) 。

1.2 方 法

1.2.1 HMW-GS样品提取 取品种(系)典型性单粒磨成粉，置于1.5 mL离心管中，加入1 mL提取液[φ=50%异丙醇]，振荡5 min，65 ℃水浴20 min，振荡5 min，11 000 r/min离心5 min，弃上清；加入100 μL提取液[20 g/L二硫苏糖醇+0.04 mol/L Tris-Hcl(pH 8.0)+100 g/L SDS]，65 ℃水浴30 min，振荡5 min，11 000 r/min离心5 min；转移100 μL上清液至1.5 mL离心管中，加入100

μL提取液[φ=20%甘油+0.625 mol/L Tris-Hcl (pH 6.8)+20 g/L SDS+2 g/L溴酚蓝]，振荡5 min，90 ℃水浴5 min，11 000 r/min离心5 min得到HMW麦谷蛋白样品。

1.2.2 SDS-PAGE 电泳 采用质量浓度130 g/L(pH 8.0)分离胶和质量浓度48 g/L

(pH 6.8)浓缩胶进行电泳，每孔上样量7 μL，电极缓冲液为0.025 mol/L Tris、0.192 mol/L甘氨酸、1 g/LSDS，pH 8.3。每板胶电流11～12 mA电泳16 h。卸胶后迅速水洗约5 min，再在120 g/L三氯乙酸溶液中固定10 min，然后用10 g/L考马斯亮蓝溶液染色1 d，用自来水脱色至背景清晰。根据Payne等[17]的方法判定HMW-GS，并记录结果。

表1 供试47份小麦品种Table 1 47 wheat cultivars in this experment编 号Code品 种Cultivar编 号 Code 品 种Cultivar1徐州24 Xumai 2425烟辐188

Yanfu 1882徐州25 Xumai 2526烟农19 Yannong 193徐麦856 Xumai

85627烟农25 Yannong 254徐麦30 Xumai 3028烟农26 Yannong 265徐麦31 Xumai 3129济麦20 Jimai 206徐麦32 Xumai 3230济6487 Ji 64877连5152 Lian 515231冀师02-1 Jishi 02-18淮麦18 Huaimai 1832河农58-3

Henong 58-39淮麦20 Haimai 2033藁城8901 Gaocheng 890110淮麦30

Haima i3034藁9407 Gao 940711豫麦34 Yumai 3435 石优17 Shiyou 1712郑麦366 Zhengmai 36636 石优20 Shiyou 2013郑麦7698 Zhengmai

769837 石B07-4056 ShiB 07-405614郑379 Zheng 37938 皖麦38 Wanmai

3815内乡188 Neixing 18839 西农979 Xinong 97916矮抗58 Aikang 5840

中优9507 Zhongyou 950717新麦19 Xinmai 1941 中优9507RHT Zhongyou

9507RHT18新麦26 Xinmai 2642 中优206 Zhongyou 20619周麦16

Zhoumai 1643 Mushat20周麦18 Zhoumai 1844 Tabasco21周麦24

Zhoumai 2445 徐麦8133 Xumai 813322存麦1号Cunmai 146 徐麦29

Xumai 2923烟5158 Yan 515847 莱州137 Laizhou 13724烟5286 Yan 5286

1.2.3 分子标记检测 本研究采用酚-氯仿法从新鲜叶片中提取供试材料的基因组DNA。所有PCR反应体系总体积均为25 μL，均含PCR bufer(Mg2+ Free)2.5

μL、MgCl2(25 mmol/L )1.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L )2 μL、Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)0.6 μL、单一PCR引物10 pmol、DNA模板50～100 ng。在研究中，PCR体系共涉及5个基因的特异性分子标记，引物序列及其预期扩增特异条带的大小列于表2。 Dx5、 Ax2*、 By8、 By9和 By17的分子标记检测分别参考Anderson等[18]、Ma等[19]、Lei等[20]和Butow等[21]的方法进行，PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶80V恒压电泳1.5 h。

2 结果与分析

2.1 供试小麦种质的HMW-GS 组成

47份小麦种质资源的HMW-GS组成详列于表3 。在所检测的小麦品种(系)中，共检测到 Glu-A1位点编码的HMW-GS有3种类型，分别是Null、1和2* ,其中1出现频率较高(80.9%)，Null次之(17.0%)，2*仅有1份； Glu-B1位点编码的HMW-GS有7+8、7+9、1 +18共3种类型，其中7+8和7+9出现的频率较高，分别为48.9%和44.7%； Glu-D1位点编码的HMW-GS有2+12、5+10、4+12共3种类型，其中5+10出现的频率最高(61.7%) 。

表2 标记引物序列及其片段大小Table 2 Sequences and expected

amplification fragment sizes of the primers used in this study等位基因

Gene引物序列Sequence(5'→3')扩增片段大小/bpSize of product退火温度/℃Annealing temperature参考文献Reference

Dx5GCCTAGCAACCTTCACATC45063[7]GAAACCTGCTGCGGACAAC

Ax2*ATGACTAAGCGGTTGGTTCTT 1 3195

658[19]ACCTTGCTCCCCTTGTCTTT By8TTAGCGCTAAGTGCCGTCT

52764[20]TTGTCCTATTTGCTGCCCTT

By9TTCTCTGCATCAGTCAGGA66259[20]AGAGAAGCTGTGTAARGCC

By17CGCAACAGCCAGGACAATT67559[20]AGAGTTCTATCACTGCCTGGT

2.2 分子标记检测结果

检测结果显示，在所检测47份材料中含 Dx5基因的材料最多，共计29份，出现频率为61.7%；含 Ax2*基因的材料仅有1份，含 By8、 By9和 By17基因的材料依次为23、21、3份，频率依次为48.9%、44.7%、6.4%。在所检测小麦品种(系)中含最优亚基组合 Dx5、 By8的材料共13份，频率为27.7%。其结果与SDS-PAGE检测结果一致。图1为17份材料检测 Dx5基因结果，其中，徐州24等6份材料不含有 Dx5亚基；徐麦30等11份材料含有 Dx5亚基，扩增出450

bp的预期条带。

2.3 供试小麦种质的HMW-GS 组合及其频率

表4为HMW-GS组合分布频率。参试品种中携带与面包烘烤品质呈正相关的优质亚基5+10材料有29份占61.7%；具有面包麦优质亚基组合类型1/17+18/5+10的种质材料有3份(连5152、烟农19和冀6487)仅占6.4%。从亚基组成情况来看，本实验检测到的面包麦优质亚基组合类型有1/7+8/5+10和1/17+18/5+10，出现频率分别为25.5%和6.4%。47份供试材料中,适合制作优质手工馒头的亚基组合是1/7+8/2+12和Null/7+8/2+12，出现频率仅分别为6.4%和4.3%。

表3 50 份供试小麦种质材料的HMW-GS 组成Table 3 HMW-GS components

of 50 wheat cultivars品种Cultivar Glu-A1 Glu-B1 Glu-D1品种Cultivar Glu-A1 Glu-B1 Glu-D1徐州24 Xumai 2417+82+12烟辐188 Yanfu

188N7+94+12徐州25 Xumai 25N7+92+10烟农19 Yannong

19117+185+10徐麦856 Xumai 8562*7+82+12烟农25 Yannong

2517+85+10徐麦30 Xumai 3017+85+10烟农26 Yannong 2617+85+10徐麦31 Xumai 3117+94+12济麦20 Jimai 2017+82+12徐麦32 Xumai

3217+85+10济6487 Ji 6487117+185+10连5152 Lian 5152117+185+10冀师02-1 Jishi 02-117+95+10淮麦18 Huaimai 1817+85+10河农58-3

Henong 58-3N 7+82+12淮麦20 Haimai 2017+84+12藁城8901 Gaocheng

890117+95+10淮麦30 Haima i30N7+85+10藁9407 Gao 940717+85+10豫麦34 Yumai 3417+85+10石优17 Shiyou 1717+95+10郑麦366

Zhengmai 36617+85+10石优20 Shiyou 2017+85+10郑麦7698 Zhengmai

769817+95+10石B07-4056 ShiB 07-405617+95+10郑379 Zheng

37917+95+10皖麦38 Wanmai 3817+84+12内乡188 Neixing

18817+85+10西农979 Xinong 97917+82+12矮抗58 Aikang 5817+84+12中优9507 Zhongyou 950717+95+10新麦19 Xinmai 1917+95+10中优9507RHT Zhongyou 9507RHTN7+95+10新麦26 Xinmai 2617+95+10中优206 Zhongyou 20617+95+10周麦16 Zhoumai

1617+92+12MushatN7+92+12周麦18 Zhoumai

1817+92+12TabascoN7+92+12周麦24 Zhoumai 2417+92+12徐麦8133

Xumai 813317+95+10存麦1号Cunmai 1*17+84+12徐麦29 Xumai

29N7+82+12烟5158 Yan 515817+85+10莱州137 Laizhou 13717+95+10烟5286 Yan 528617+85+10

2 000;1～17为品种编号同(表1) 1-17 samples are same as in Table 1图1 部分供试品种 Dx5基因分子检测结果Fig.1 Dx5 gene detection results of

some tested wheat cultivars表4 47 份供试小麦种质材料的HMW-GS基因型频率Table 4 HMW-GS frequency of 47 wheat cultlvars

Glu-A1 Glu-B1 Glu-D1材料数Number of cultivar频率/%Frequency of

lociNull7+82+1224.3Null7+85+1012.1Null7+92+1012.1Null7+94+1212.1Null7+95+1012.1Null7+92+1224.317+82+1236.417+85+101225.517+84+1248.517+94+1212.117+95+101225.517+92+1236.4117+185+1036.42*7+82+1212.1

3 讨 论

李博等[22]研究结果表明，黄淮麦区小麦品种的HMW-GS组成是比较丰富的，但适宜于面包专用小麦选育的黄淮麦区小麦种质资源中优质亚基和优质亚基组合偏少且较为单一。本实验所检测到的具有面包优质亚基组合类型1/17+18/5+10的种质材料只有3份，与前人研究结果一致。根据范玉顶等[23]和赵京岚等[11]研究结果,本研究的47份供试材料中,适合制作优质手工馒头的亚基组合是1/7+8/2+12和Null/7+8/2+12，出现频率分别为6.4%和4.3%，可见黄淮麦区的小麦种质资源中适合馒头的专用品种还不充足。因此，遗传背景多样、携带不同优质HMW-GS的种质材料的引进、筛选与利用是黄淮地区品质育种当务之急。在亲本选配及后代选择中，应尽量选用含优质HMW-GS如1、2*、17+18和5+10的材料。因为基因间存在互补作用，单凭亚基的存在与否进行品质评价是不够的，还应考虑位点互作的效应，在优质育种的亲本选配和后代选择中，优质亚基组合比单个优质亚基更有实际指导意义。本研究筛选出含有1、2*、17+18、5+10等优质亚基和优质亚基组合的品种,可作为杂交亲本，用于小麦品种的品质改良，也可作为优质亚基基因克隆的基础材料，进行优质亚基基因的转育。

近年来，高分子量麦谷蛋白电泳技术在国内各育种单位得到广泛的应用，为优质强筋小麦新品种培育提供生化标记手段，对加速中国优质品种的选育做出很大贡献。SDS-PAGE电泳必须以收获后的小麦籽粒为材料，这样在时间上滞后于大田综合选择，无形增加收获工作量。此外，麦谷蛋白作为基因产物，其多样性只是DNA多态性的一部分，且其特异性易受环境条件和发育阶段影响。PCR分子跟踪检测既可是籽粒，也可是苗期任何组织，不受农事时间、地点限制，加之大规模、高通量DNA提取技术已成熟，使得育种者完全可以在小麦收获前或开花授粉前确定相关种质材料HMW-GS的相关信息。此外，PCR分子标记技术简单、经济、快速、高效，便于在小麦育种单位中普及利用，是进一步加快优质强筋小麦育种进程和提高育种效率的首选手段。但与众多谷蛋白亚基基因相比，目前设计的标记引物还是甚少，能准确快速鉴定的亚基也仅限于几种。因此，在小麦品种的品质改良工作中应加强分子标记技术的应用，提高小麦品种中优质亚基的筛选效率。

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