RET的抑制剂

无菌可注射形式可为水性或油性混悬剂。这些混悬剂可根据本领域已知的技术,使

用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射的制剂也可为在无毒肠胃外

可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂,例如在1,3-丁二醇中的溶

液剂。可接受的媒介物和溶剂中可以使用的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。

此外,通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。

为此目的,可使用任何温和的不挥发性油,包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸

如油酸及其甘油酯衍生物适用于制备注射剂,天然的药学上可接受的油如橄榄油或

蓖麻油也一样,尤其是其聚氧乙烯化形式。这些油溶液剂或混悬剂还可含有长链醇

稀释剂或分散剂,如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和

混悬剂)的类似分散剂。其它常用的表面活性剂,如Tween、Spans及其它常用于制

备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配

制目的。

本发明的药学上可接受的组合物可以任何口服可接受的剂型经口施用,口服可接受

的剂型包括但不限于胶囊、片剂、水性混悬剂或溶液剂。在供经口使用的片剂的情

况下,常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂,如硬脂酸镁。对于胶囊

形式的经口施用,有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服需要水性混悬

剂时,将活性成分与乳化剂和助悬剂合并。如果需要,也可以加入某些甜味剂、调味

剂或着色剂。

或者,本发明的药学上可接受的组合物可以供直肠给药的栓剂形式施用。这些组合

物可通过将试剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备,所述赋形剂在室温下是固体,

但在直肠温度下是液体且因此将在直肠中融化释放出药物。这种材料包括可可油、

蜂蜡和聚乙二醇。

本发明的药学上可接受的组合物也可局部应用,特别是当治疗目标包括通过局部施

用容易接近的区域或器官时,包括眼睛、皮肤或下肠道的疾病。容易为这些区域或

器官中的每个制备合适的局部制剂。针对下肠道的局部应用可用直肠栓剂(参见上

文)或用合适的灌肠剂来进行。也可使用局部透皮贴剂。

对于局部应用,可将药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种载

体中的活性组分的合适的软膏剂。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于

矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和

水。或者,可将药学上可接受的组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种药学上

可接受的载体中的活性组分的合适的洗剂或霜剂。合适的载体包括但不限于矿物油、

单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、聚山梨酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二

烷醇、苄醇和水。

本发明的药学上可接受的组合物还可通过鼻用气雾剂或吸入剂来施用。这些组合物

根据药物制剂领域熟知的技术制备,并且可使用苄醇或其它合适的防腐剂、提高生

物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂在盐水中制备

成溶液。

可与载体材料组合以生成呈单一剂型的组合物的本发明化合物的量将随所治疗的宿

主和具体的施用模式而改变。

剂量

本发明化合物(包括药学上可接受的盐和氘化变体)的毒性和治疗功效可通过细胞培

养物或实验动物中的标准药物程序来确定。LD

50

是50%群体致死的剂量。ED

50

是在50%群体中治疗有效的剂量。毒性作用与治疗效果之间的剂量比率(LD

50

/ED

50

)是治疗指数。展现大治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用表现毒副作用的

化合物,但应小心设计使这些化合物靶向受影响组织的部位的递送系统,以便使对未

受感染的细胞的潜在损伤减到最低,并由此降低副作用。

可在配制用于人的剂量范围中使用由细胞培养测定和动物研究获得的数据。此类化

合物的剂量可落在包括ED

50

且几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的

施用途径而在这个范围内变化。对于任何化合物,治疗有效量可从细胞培养测定初

步评估。可在动物模型中配制剂量以获得包括如在细胞培养中所确定的IC

50

(即,实现症状的半数最大抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可

用于更准确地测定在人类中有用的剂量。血浆水平可例如通过高效液相色谱来测量。

还应理解,对于任何具体患者的特定剂量和治疗方案将根据以下多种因素而变化,包

括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、

排泄率、药物组合、以及主治医师的判断和所治疗的具体疾病的严重程度。组合物

中本发明化合物的量也将取决于组合物中的具体化合物。

治疗

RET融合蛋白在几种类型的癌症中有所涉及。通常,这些RET融合蛋白具有与野生

型RET相同的RET激酶结构域;因此,如本文所用,具有与野生型RET相同激酶结构

域的任何RET蛋白将被称为“野生型RET”。突变可发生在RET激酶结构域中,导致

RET的抗性突变体。

以下示出了经批准或开发用于RET相关病状的示例性化合物的活性。如所示,这些

化合物对野生型RET有活性,但对突变形式的活性要低得多。

本发明提供了抑制野生型RET和RET突变体的化合物,例如,对当前标准护理治疗

具有抗性的RET突变体(“RET抗性突变体”)。另外,相对于其它激酶,本发明化合物

对野生型RET可有选择性,从而导致与抑制其它激酶相关的毒性降低。

可使用结构生物学和计算分析以及通过检查其中序列变化产生用于不同氨基酸的密

码子的密码子序列来预测突变。使用这样的方法,预测RET抗性突变体在RET蛋白

的804看门残基处和/或在看门残基处或附近的残基处具有点突变。在一些实施方

案中,突变可以在804、806、810、865、870、891和918残基中的一个或多个处。

RET抗性突变体的具体实例包括:V804L、V804M、V804E、Y806C、Y806S、

Y806H、Y806N、G810R、G810S、L865V、L870F、S891A和M918T突变体。

由施用特定抑制剂(例如,已知的RET野生型抑制剂)产生的突变可通过将细胞暴露

于突变促进剂如ENU而以实验方式来确定。将细胞洗涤,然后用递增浓度(2-100X

增殖IC

50

)的所选化合物铺板。3-4周后收集细胞向外生长的孔。然后对RET激酶结构域进

行测序以鉴定抗性突变(即保留酶活性的RET蛋白的改变形式)。通过将这些细胞

暴露于所选化合物可以证实抗性。经实验鉴定的抗性突变体包括V804L、V804E、

V804M和Y806H突变体。

由于它们对野生型RET和突变RET的活性,所以本文所述的化合物可用于治疗患有

与RET异常活性相关的病状的患者。它们还可用来治疗各种癌症。在一些实施方

案中,癌症选自乳头状甲状腺癌(PTC)、甲状腺髓样癌(MTC)、嗜铬细胞瘤(PC)、胰

腺导管腺癌、多发性内分泌瘤(MEN2A和MEN2B)、转移性乳腺癌、睾丸癌、小细

胞肺癌、非小细胞肺癌、慢性骨髓单核细胞性白血病、结直肠癌、卵巢癌和唾液腺

癌。

所述化合物还可用于治疗对野生型RET抑制剂产生抗性的患者或具有特定的RET

突变体的患者。所述方法包括施用对一种或多种RET抗性突变体有活性的本发明

的化合物或组合物的步骤。在某些实施方案中,RET抗性突变体选自V804L、

V804M、V804E、Y806C、Y806S、Y806N、Y806H、G810R、G810S、L865V、

L870F、S891A和M918T。“活性”意味着化合物当在生物化学测定中测量时具有小

于1μM、500nM、250nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM或5nM的针对至

少一种抗性突变体的IC

50

。

本文所述的化合物和组合物可单独施用或与其它化合物(包括其它RET调节化合物)

或其它治疗剂组合施用。在一些实施方案中,本发明的化合物或组合物可与一种或

多种选自以下的化合物组合施用:卡博替尼(COMETRIQ)、凡德他尼(CALPRESA)、

索拉非尼(NEXAVAR)、舒尼替尼(SUTENT)、雷格拉非尼(STAVARGA)、普纳替

尼(ICLUSIG)、贝伐单抗(阿瓦斯汀)、克唑替尼(XALKORI)或吉非替尼(IRESSA)。

本发明的化合物或组合物可通过相同或不同给药途径与其它治疗剂同时或相继施用。

本发明的化合物可与其它治疗剂一起包含在单一制剂中或在单独的制剂中。

实施例

以下实施例旨在说明,并不意味着以任何方式进行限制。

本发明的化合物(包括其盐和N-氧化物)可使用已知的有机合成技术来制备,并且可

根据许多可能的合成路线中的任一个来合成,例如下文和实施例中的合成方案中的

那些。以下方案意在提供关于制备本发明化合物的一般指导。本领域技术人员将理

解,可使用有机化学的一般知识来修改或优化方案中所示的制备物以制备本发明的

各种化合物。

合成方案1:

芳基二卤化物可用卤化有机锂或卤化有机镁试剂(如n-BuLi或i-PrMgCl)处理,然后

可将芳基金属试剂加入到酯取代的环己酮(可商购获得或如“酮和硼酸酯中间体的合

成”中所述制备)中。剩余的卤化物可接着在SnAr条件或金属催化的偶合条件下与

芳胺进行偶合反应,得到三环酯中间体。然后酯可在碱性条件下水解成酸,随后可与

胺(可商购获得或如“胺中间体的合成”中所述制备)进行酰胺偶合反应。酰胺是本文

所述的RET抑制剂的实例,但也可进一步被修饰。例如,叔醇可用氟化试剂如DAST

处理以得到脱氧氟化产物和脱水产物的混合物。脱水产物可在典型的氢化条件如

Pd和H

2

或者Pd和甲酸铵下被还原,得到还原产物,该产物也是RET抑制剂的实例。

合成方案2:

杂芳基二卤化物可在亲核芳族取代反应条件下使用碱如二异丙基乙胺(DIPEA)或三

乙胺(TEA)在极性溶剂中偶合至氨基吡唑以提供双环系统。双环杂芳基卤化物然后

可通过钯介导的偶合反应(例如,Suzuki、Stille、Negishi偶合)偶合到硼、锡或锌烯

基或烷基试剂上,以提供三环系统。例如,在合成方案2中,可在Suzuki偶合反应条件

下(X=卤基,例如,氯;且M=B(OR)

2

)将双环杂芳基卤化物偶合至多种酯取代的环己烯基硼酸酯(可商购获得或在标题

“乙烯基硼酸酯的合成”下所述的那些),以提供三环羧酸酯中间体。然后可在酸性或

碱性条件下水解羧酸酯,得到羧酸中间体。随后可将羧酸中间体偶合到各种胺中间

体上,如实施例9中所述的那些,以提供酰胺终产物。

合成方案3:

用活化的锌处理取代的环烷基碘(可商购获得或如“碘化物中间体的合成”中所述制

备)。然后通过各种方法活化锌,包括但不限于Reike方法或用TMS-Cl和1,2-二溴乙

烷处理。环烷基锌试剂可接着在Negishi偶合条件下在钯催化下偶合至杂芳基卤化

物。然后可通过以下步骤将所得产物的硫甲基转化为氯化物:氧化成砜,在酸性条件

下水解,并用POCl

3

或草酰氯进行氯化。随后可在SnAr条件或钯介导的偶合条件下,用芳基胺置换杂芳

基氯化物。接着可在酸性或碱性条件下水解三环羧酸酯以提供羧酸中间体。然后可

将羧酸中间体偶合到多种胺中间体上,如实施例9中所述的那些中间体,以提供酰胺

终产物。

合成方案4:

用活化的锌处理取代的环烷基碘(可商购获得或如“碘化物中间体的合成”中所述制

备)。可通过多种方法活化锌,包括但不限于Reike方法或用TMS-Cl和1,2-二溴乙烷

处理。然后可在Negishi偶合条件下在钯催化下将环烷基锌试剂偶合至杂芳基二卤

化物。接着可在SnAr条件或钯介导的偶合条件下,用芳基胺置换所得产物的剩余卤

化物基团。芳基胺可以是未受保护的,或吡唑N-H可被如Boc的多种基团保护。然

后可在酸性或碱性条件下水解三环羧酸酯以提供羧酸中间体,由此也从吡唑中除去

保护基团。随后可将羧酸中间体偶合到多种胺中间体上,如“胺中间体的合成”中所

述的那些中间体,以提供酰胺终产物。

用于制备本发明化合物的反应可在合适的溶剂中进行,所述溶剂可易于由有机合成

领域的技术人员选择。合适的溶剂在反应进行的温度(例如,温度范围可从溶剂的冷

冻温度至溶剂的沸腾温度)下与起始物质(反应物)、中间体或产物基本上不反应。给

定的反应可在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。取决于具体的反应步骤,

本领域技术人员可选择用于特定反应步骤的合适溶剂。

本发明化合物的制备可涉及各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可易于

确定对保护和脱保护的需求以及适当保护基团的选择。保护基团的化学性质可见于

例如Wuts和Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第5

版,JohnWiley&Sons:NewJersey,(2014)中,其全部内容通过引用并入本文。

可根据本领域已知的任何合适的方法来监测反应。例如,可通过以下方法来监测产

物形成:光谱手段,如核磁共振(NMR)光谱(例如,

1

H或

13

C)、红外(IR)光谱、分光光度法(例如,UV-可见)、质谱(MS);或色谱方法,如高效液相

色谱(HPLC)或薄层色谱(TLC)。用于化合物表征的分析仪器和方法:

LC-MS

:除非另有说明,所有液相色谱-质谱(LC-MS)数据(针对纯度和特性分析的样品)用

Agilent型号-1260LC系统,使用Agilent型号6120型质谱仪,利用装备有

AgilentPoroshel120(EC-C18,2.7μm粒径,3.0×50mm尺寸)反相柱(在22.4°C下)的ES-

API电离获得。流动相是由0.1%甲酸的水溶液和0.1%甲酸的乙腈溶液混合物组成。

利用在4分钟的过程中从95%含水/5%有机至5%含水/95%有机流动相的恒定梯度。

流速恒定在1mL/min。

制备型LC-MS

:制备型HPLC是在ShimadzuDiscovery

制备系统上进行,所述制备系统配备有Luna5uC18(2)100A,AXIA填充的

250x21.2mm反相柱(在22.4°C下)。流动相是由0.1%甲酸的水溶液和0.1%甲酸的

乙腈溶液混合物组成。利用在25分钟的过程中从95%含水/5%有机至5%含水/95%

有机流动相的恒定梯度。流速恒定在20mL/min。在BiotageInitiator微波单元中进

行微波反应。

硅胶色谱法:

在TeledyneIsco

Rf单元或

IsoleraFour单元上进行硅胶色谱。

质子NMR

:除非另有说明,所有

1

HNMR谱均是用Varian400MHzUnityInova400MHzNMR仪器(采集时间=3.5秒,1秒

延迟;16至64次扫描)获得。在表征中,所有质子均在DMSO-d6溶剂中以相对于残

余DMSO(2.50ppm)的百万分率(ppm)报告。

实施例1.化合物109和110的合成。

步骤1:合成(1R,4S)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-

甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物109)和(1S,4R)-N-((S)-1-(6-

(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-

基)环己烷甲酰胺(化合物110)

将N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-

基)氨基)吡啶-2-基)环己-3-烯甲酰胺(50mg,0.10mmol)和10%Pd/C(20mg)的

MeOH(5mL)溶液在H

2

氛围(1atm)下在环境温度下搅拌1小时。然后将混合物经由硅藻土垫过滤,并且将过

滤的溶液浓缩并通过制备型HPLC纯化,得到呈白色固体状的标题化合物(1R,4S)-N-

((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)

吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物109;10.0mg,19.9%)和(1S,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-

吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷

甲酰胺(化合物110;24.8mg,49.5%)。MS(ES+)C

27

H

31

FN

8

O理论值:502;实测值:503[M+H]

+

。

(1R,4S)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡

唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物109):

1

H-NMR(400MHz,DMSO-

d6)δppm11.66(s,1H),8.82(s,1H),8.68(d,1H,J=4.4Hz),8.39(s,1H),8.35(d,1H,J=6.8Hz),7.92

-7.86(m,3H),6.89(s,1H),6.37(s,1H),6.12(s,1H),5.00-4.97(m,1H),2.50-2.44(m,1H),2.40-

2.15(m,7H),1.90-1.85(m,4H),1.55-1.45(m,4H),1.40(d,3H,J=6.4Hz)。

(1S,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡

唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物110):

1

H-NMR(400MHz,DMSO-

d6)δppm11.62(s,1H),8.78(s,1H),8.66(d,1H,J=4.4Hz),8.38(d,1H,J=1.6Hz),8.23(d,1H,J=7.

6Hz),7.93-7.84(m,3H),6.83(s,1H),6.35(s,1H),6.15(s,1H),5.03-5.00(m,1H),2.59-

2.50(m,1H),2.50-2.46(m,1H),2.14-2.02(m,6H),2.02-1.84(m,4H),1.63-

1.55(m,4H),1.40(d,3H,J=7.6Hz)。

实施例2.化合物112的合成。

步骤1:合成2-氯-6-甲基-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-4-胺

将2,4-二氯-6-甲基-嘧啶(120.00g,736.2mmol,1.00eq)、5-甲基-1H-吡唑-3-胺

(78.65g,0.81mol,1.10eq)和DIPEA(142.72g,1.10mol,1.50eq)在DMSO(400.00mL)中的

悬浮液在60°C下加热16小时,此时TLC(PE/EA,5:1,1:1)分析显示反应完成。将反应

混合物冷却至30°C,倒入冰水(800mL)中,并将得到的混合物用MTBE(800mL×10)萃

取。将合并的有机层用水(400mL×3)、盐水(400mL×3)洗涤并经Na

2

SO

4

干燥。过滤后,减压浓缩滤液,并将残余物由DCM(10mL/g)重结晶,得到呈黄色固体

状的2-氯-6-甲基-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-4-胺(105.60g,472.14mmol,64%)。结

构通过LC-MS和NMR证实。

步骤2:合成4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙

酯

将2-氯-6-甲基-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-4-胺(0.530g,2.37mmol)、4-(4,4,5,5-四

甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯甲酸乙酯(0.664g,2.37mmol)和碳酸钾

(0.819g,5.92mmol)在二噁烷(8.89ml)和水(2.96ml)中的混合物用氮气鼓泡10分钟,然

后加入Pd(PPh

3

)

4

(0.137g,0.118mmol)并将反应容器密封。将反应混合物在微波反应器中在125°C下

加热80分钟,然后冷却至环境温度并在5:1DCM/IPA与水之间分配。将水层进一步

用5:1DCM/IPA萃取。将有机层合并,并经硫酸钠干燥。将干燥的溶液过滤,浓缩并

通过硅胶色谱法(梯度洗脱,0至10%甲醇-DCM)纯化,得到黄色固体状的4-(4-甲基-6-

((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯(646mg,80%)。

MS(ES+)C

18

H

23

N

5

O

2

理论值:341;实测值:342[M+H]

+

。

步骤3:合成4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯。

将钯碳(10wt%,0.125g,0.117mmol)和甲酸铵(0.296g,4.69mmol)加入到4-(4-甲基-6-((5-

甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己-3-烯甲酸乙酯(0.40g,1.2mmol)的乙醇

(11.7ml)溶液中,并将所得混合物加热至70°C并持续30分钟。将反应混合物冷却至

环境温度,并经由硅藻土过滤,用甲醇冲洗硅藻土。然后将过滤的溶液浓缩到硅胶上

并通过硅胶色谱法(梯度洗脱,0至10%甲醇-DCM)纯化,得到4-(4-甲基-6-((5-甲基-

1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酸乙酯,呈顺式:反式的3:1混合物。

MS(ES+)C

18

H

25

N

5

O

2

理论值:343;实测值:344[M+H]

+

。

步骤4:合成4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酸

在环境温度下将氢氧化锂一水合物(0.029g,0.70mmol)添加到4-(4-甲基-6-((5-甲基-

1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酸乙酯(0.12g,0.35mmol)于THF(2.8mL)、

EtOH(2.8mL)和水的溶液中。将反应混合物搅拌6小时,然后加入浓HCl水溶液

(37%,0.072ml,0.87mmol)。将反应混合物浓缩并用于下一步中。

步骤5:合成(1R,4S)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-

甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酰胺(化合物112)

在环境温度下将HATU(162mg,0.427mmol)加入到粗制的4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-

吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酸(72mg,0.23mmol)、(S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-

基)吡啶-3-基)乙胺盐酸盐(97mg,0.40mmol)和DIEA(0.34mL,1.9mmol)于DMF(3.8mL)

中的溶液中。将反应混合物搅拌10分钟,然后在EtOAc与H

2

O之间分配。将有机层用饱和NaCl水溶液洗涤,经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。将残余

物通过硅胶色谱法(梯度洗脱0-10%甲醇-二氯甲烷,添加有2%三乙胺)纯化,得到白色

固体状的(1R,4S)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-((5-甲

基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酰胺(化合物112;26mg,13%产率)。

MS(ES+)C

26

H

30

FN

9

O理论值:503;实测值:504[M+H]

+

。

1

HNMR(500MHz,DMSO-

d6)δ11.88(s,1H),9.48(s,1H),8.66(d,J=4.5Hz,1H),8.38(d,J=2.2Hz,1H),8.30(d,J=7.7Hz,1H)

,7.94–7.81(m,3H),6.83(s,1H),6.16(s,1H)5.02–4.93(m,1H),2-57-2.49(m,1H),2.26-

2.16(m,7H),1.99-1.92(m,2H),1.88-1.80(m,2H),1.58-1.36(m,7H)。

实施例3.化合物120的合成。

步骤1:合成(1S,4S)-4-(6-溴-4-甲基吡啶-2-基)-4-羟基环己烷甲酸乙酯和(1R,4R)-4-(6-

溴-4-甲基吡啶-2-基)-4-羟基环己烷甲酸乙酯

将2,6-二溴-4-甲基吡啶(1.00g,3.98mmol)在DCM(30mL)中的溶液冷却至-78°C,并且

在-78°C下将n-BuLi(2.5M,1.74mL,4.37mmol)逐滴添加到上述溶液中。将该溶液在-

78°C下搅拌15分钟,接着添加4-氧代环己烷甲酸乙酯(811mg,4.77mmol),并将所得

混合物在-78°C下搅拌30分钟。然后通过加入饱和NH

4

Cl水溶液淬灭混合物并用DCM萃取。将有机层合并,经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。

通过硅胶柱(PE:EA=2:1)纯化残余物以得到白色固体状的(1R,4R)-4-(6-溴-4-甲基吡

啶-2-基)-4-羟基环己烷甲酸乙酯(通过TLC测得极性较小,500mg,36.7%),MS(ES+)C

15

H

20

BrNO

3

理论值:341,实测值:342[M+H]

+

;和白色固体状的(1S,4S)-4-(6-溴-4-甲基吡啶-2-基)-4-羟基环己烷甲酸乙酯(通过TLC

测得极性较大,500mg,36.7%)。MS(ES+)C

15

H

20

BrNO

3

理论值:341,实测值:342[M+H]

+

。

步骤2:合成(1S,4S)-4-羟基-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷

甲酸乙酯

将(1s,4s)-4-(6-溴-4-甲基吡啶-2-基)-4-羟基环己烷甲酸乙酯(500mg,1.46mmol)、5-甲

基-1H-吡唑-3-胺(283mg,2.92mmol)、t-BuXPhos(185mg,0.438mmol)、Pd

2

(dba)

3

(200mg,0.219mmol)和KOAc(429mg,4.38mmol)在DMF(2mL)和甲苯(10mL)中的混合

物在微波照射下加热至140°C并持续2小时。冷却至环境温度后,将混合物浓缩并

通过硅胶柱(PE:EA=1:2)纯化,得到白色固体状的(1s,4s)-4-羟基-4-(4-甲基-6-(5-甲基-

1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酸乙酯(80mg,15%)。MS(ES+)C

19

H

26

N

4

O

3

理论值:358;实测值:359[M+H]

+

。

步骤3:合成(1S,4S)-4-羟基-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷

甲酸

在25°C下向(1S,4S)-4-羟基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)环己

烷甲酸乙酯(80mg,0.2231mmol)于MeOH(3mL)中的溶液中添加2MNaOH水溶液

(0.5mL,1mmol)。将该溶液在25°C下搅拌15小时,然后浓缩以除去MeOH。将水溶

液用2MHCl酸化以使pH值达到6,这导致沉淀形成。收集沉淀的固体并干燥,得到

黄色固体状的(1S,4S)-4-羟基-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己

烷甲酸(60mg,81%)。MS(ES+)C

17

H

22

N

4

O

3

理论值:330;实测值:331[M+H]

+

。

步骤4:合成(1s,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-羟基-4-(4-甲

基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物120)

将(1S,4S)-4-羟基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酸

(60mg,0.18mmol)、(S)-1-(6-(4-氟-1H吡啶-1-基)吡啶-3-基)乙胺盐酸盐

(44.0mg,0.1816mmol)、HATU(69.0mg,0.1816mmol)和DIEA(70.4mg,0.545mmol)于

DMA(2mL)中的混合物在25°C下搅拌2小时。将溶液浓缩并通过制备型HPLC纯

化,得到白色固体状的标题产物(40mg,43%)。MS(ES+)C

27

H

31

FN

8

O

2

理论值:518;实测值:519[M+H]

+

。

1

H-NMR(400MHz,DMSO-

d6)δppm11.71(br.s.,1H),8.92(br.s.,1H),8.69(d,1H,J=4.4Hz),8.39(d,1H,J=2.0Hz),8.31(d,1

H,J=7.6Hz),7.95-7.87(m,3H),6.83(br.s.,1H),6.79(s,1H),6.09(br.s.,1H),5.01-

4.98(m,1H),4.89(s,1H),2.50-2.48(m,1H),2.21(s,3H),2.20(s,3H),2.00-1.75(m,4H),1.65-

1.50(m,4H),1.41(d,3H,J=7.2Hz)。

实施例4.化合物121和122的合成。

步骤1:合成(1s,4R)-4-氟-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-

6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物121)、(1R,4S)-4-氟-N-

((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)

吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物122)和N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)

乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己-3-烯甲酰胺

将(1R,4S)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-羟基-4-(4-甲基-6-((5-甲

基-1H-吡唑-3-基)氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(120mg,0.23mmol)于DCM(6mL)中

的混合物冷却至0。°C在0°C下将DAST(111mg,0.69mmol)加入到混合物中,并且在

25°C下搅拌所得的混合物2小时。将混合物浓缩并通过制备型HPLC纯化,得到白

色固体状的标题化合物(1S,4R)-4-氟-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙

基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物

121;6.1mg,5.08%)和(1R,4S)-4-氟-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-

(4-甲基-6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物

122;13.2mg,11.0%)。MS(ES+)C

27

H

30

F

2

N

8

O理论值:520;实测值:521[M+H]

+

。还得到白色固体状的N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-

6-(5-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己-3-烯甲酰胺(50mg,43.4%)。MS(ES+)C

27

H

29

FN

8

O理论值:500;实测值:501[M+H]

+

。

(1S,4R)-4-氟-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-

1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物121):

1

H-NMR(400MHz,DMSO-

d6)δppm11.73(s,1H),9.01(d,1H,J=2.8Hz),8.69(d,1H,J=4.4Hz),8.41-8.38(m,2H),7.95-

7.87(m,3H),6.92(s,1H),6.66(s,1H),6.14(s,1H),5.00(q,1H,J=7.2Hz),2.50-2.31(m,1H),2.21-

2.21(m,6H),2.21-1.74(m,8H),1.41(d,3H,J=7.2Hz)。

(1R,4S)-4-氟-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-4-(4-甲基-6-(5-甲基-

1H-吡唑-3-基氨基)吡啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物122):

1

H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm11.65(s,1H),9.01(s,1H),8.65(d,1H,J=4.4Hz),8.38-

8.33(m,2H),7.92-7.84(m,3H),6.83(s,1H),6.67(s,1H),6.30(s,1H),5.04(q,1H,J=7.2Hz),2.70-

2.50(m,3H),2.20(s,3H),2.15(s,3H),2.21-1.70(m,6H),1.40(d,3H,J=7.2Hz)。

实施例5:化合物129和130的合成。

步骤1:合成2-氯-4-甲基-6-(甲硫基)嘧啶

将2,4-二氯-6-甲基嘧啶(20.0g,0.123mol)溶于THF(200mL)中。在-5°C下逐滴添加

MeSNa(20%水溶液,43g,0.129mol),并将所得混合物在室温下搅拌过夜。添加H

2

O(100mL)和EtOAc(100mL),并分离各层。将有机层用盐水(2x)洗涤,经硫酸钠干燥

并浓缩,得到黄色固体。将固体用PE(100mL)洗涤,得到目标化合物(9.1g)。

MS(ES+)C

6

H

7

ClN

2

S理论值:174;实测值:175[M+H]

+

。

步骤2:合成1-甲氧基-4-(4-甲基-6-(甲硫基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酸甲酯

在N

2

气流下,在压力容器中将4-碘-1-甲氧基环己烷甲酸甲酯(1.35g,4.53mmol)溶解于二甲

基乙酰胺(10mL)中。经由注射器快速加入Rieke锌(5.7mL的50mg/mL在THF中的

悬浮液,4.34mmol),并将容器加盖并在环境温度下搅拌15分钟。将该容器在N

2

气流下打开并且添加2-氯-4-甲基-6-(甲硫基)嘧啶(659mg,3.8mmol),然后添加PdCl

2

dppf(138mg,0.19mmol)。将容器加盖并加热至80°C持续1小时,然后冷却至室温。

将反应混合物用EtOAc稀释,经由硅藻土过滤,并且将滤液用H

2

O(3x)、盐水洗涤,经由硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱,0

至30%EtOAc-己烷)纯化所得残余物,得到呈无色油状的1-甲氧基-4-(4-甲基-6-(甲硫

基)嘧啶-2-基)环己烷甲酸甲酯(828mg,70%)。通过LC/MS中的UV峰积分和NMR

积分,确定产物为约3:2的异构体混合物。MS(ES+)C

15

H

22

N

2

O

3

S理论值:310;实测值:311[M+H]

+

。

步骤3:合成1-甲氧基-4-(4-甲基-6-(甲基磺酰基)嘧啶-2-基)环己烷-1-甲酸甲酯

在环境温度下将1-甲氧基-4-(4-甲基-6-(甲硫基)嘧啶-2-基)环己烷甲酸甲酯

(825mg,2.66mmol)溶于DCM(12mL)中,接着添加mCPBA(1.10g,6.38mmol)。将反应

混合物搅拌16小时,然后添加另一份mCPBA(200mg)。再搅拌4小时后,将反应混合

物用DCM稀释,然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将洗涤过的溶液经由硫酸钠干燥,

过滤,浓缩,并将所得残余物通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱,0至60%乙酸乙酯-己

烷)纯化,得到呈无色油状1-甲氧基-4-(4-甲基-6-(甲基磺酰基)嘧啶-2-基)环己烷甲酸

甲酯(808mg,89%)。MS(ES+)C

15

H

22

N

2

O

5

S理论值:342;实测值:343[M+H]

+

。

步骤4:合成4-(4-羟基-6-甲基嘧啶-2-基)-1-甲氧基环己烷-1-甲酸甲酯

将1-甲氧基-4-(4-甲基-6-(甲基磺酰基)嘧啶-2-基)环己烷甲酸甲酯(600mg,1.75mmol)

溶于乙酸(5mL)中并加热至80°C持续1小时。然后将反应混合物冷却至环境温度,

减压浓缩,用H

2

O研磨,并过滤。用另一些H

2

O洗涤固体,然后减压干燥,得到淡黄色固体状的标题化合物4-(4-羟基-6-甲基嘧啶-

2-基)-1-甲氧基环己烷甲酸甲酯(390mg,79%)。MS(ES+)C

14

H

20

N

2

O

4

理论值:280;实测值:281[M+H]

+

。

步骤5:合成4-(4-氯-6-甲基嘧啶-2-基)-1-甲氧基环己烷-1-甲酸甲酯

将4-(4-羟基-6-甲基嘧啶-2-基)-1-甲氧基环己烷甲酸甲酯(380mg,1.36mmol)悬浮于

POCl

3

(3.2mL,33.9mmol)中并加热至100°C持续2小时。然后将反应混合物冷却至环境温

度,浓缩,并用碎冰处理残余物。将所得的悬浮液用DCM分配,并且将有机层用饱和

碳酸氢钠溶液萃取并经由硫酸钠干燥。将干燥的溶液过滤,浓缩,并将所得残余物通

过硅胶快速柱色谱(梯度洗脱,0至30%乙酸乙酯-己烷)纯化,得到浅橙色油状的4-(4-

氯-6-甲基嘧啶-2-基)-1-甲氧基环己烷甲酸甲酯(344mg,85%),其在静置后固化。

MS(ES+)C

14

H

19

ClN

2

O

3

理论值:298;实测值:299[M+H]

+

。

步骤6:合成1-甲氧基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷-1-

甲酸甲酯

将4-(4-氯-6-甲基嘧啶-2-基)-1-甲氧基环己烷甲酸甲酯(300mg,1.00mmol)、3-甲基-1-

吡唑-5-胺(146mg,1.51mmol)、二-叔丁基(2',4',6'-三异丙基-[1,1’-联苯]-2-基)膦

(85mg,0.2当量)Pd

2

(dba)

3

(92mg,0.1当量)和乙酸钾(394mg,4.02mmol)在氮气下在小瓶中合并,并添加4mL二

噁烷。将反应混合物加热至100°C持续1小时,然后冷却至环境温度。将反应混合

物用EtOAc稀释,经由硅藻土过滤,浓缩,并通过硅胶快速柱色谱(梯度洗脱,0至10%

甲醇-二氯甲烷)纯化所得残余物,得到褐色泡沫状的1-甲氧基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-

1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酸甲酯(192mg,53%)。MS(ES+)C

18

H

25

N

5

O

3

理论值:359;实测值:360[M+H]

+

。

步骤7:合成(1R,4S)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-1-甲氧基-4-(4-

甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物129)和(1S,4R)-

N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-1-甲氧基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-

吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物130)

使用合成方案1和2中概述的相同的两步程序(水解和酰胺偶合),用PyBOP作为酰

胺偶合剂代替HATU,由1-甲氧基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-

基)环己烷甲酸甲酯(192mg,0.53mmol)制备标题化合物。产物最初作为非对映异构

体混合物(190mg)而分离,然后将其溶解于6mL甲醇中并通过SFC(ChiralPakAD-

H21x250mm,含有于CO

2

中的0.25%DEA的40%MeOH,2.5mL注入液,70mL/min)纯化。将峰1浓缩,得到白

色固体状的(1R,4S)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-1-甲氧基-4-(4-

甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酰胺(29mg,10%)。将峰2浓

缩,得到白色固体状的(1s,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-1-甲

氧基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酰胺(130mg,46%)。

实施例6.化合物149的合成

步骤1:合成4-(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)-1-甲氧基环己烷-1-甲酸甲酯

在N

2

气流下,在压力容器中将4-碘-1-甲氧基环己烷甲酸甲酯(3.37g,11.3mmol)溶解于二甲

基乙酰胺(38mL)中。经由注射器快速加入Rieke锌(17.7mL的50mg/mL在THF中

的悬浮液,13.6mmol),并将容器加盖并在环境温度下搅拌15分钟。将容器在N

2

气流下打开并且添加2,4-二氯-6-甲基嘧啶(1.84g,11.3mmol),然后添加PdCl

2

dppf(826mg,1.13mmol)。将容器加盖并加热至80°C持续1小时,然后冷却至室温。

将反应混合物用EtOAc稀释,经由硅藻土过滤,并且将滤液用H

2

O(3x)、盐水洗涤,经由硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱,0

至50%EtOAc-己烷)纯化所得残余物,得到无色油状的4-(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)-1-甲

氧基环己烷-1-甲酸甲酯(74mg,2.2%)。MS(ES+)C

14

H

19

ClN

2

O

3

理论值:298;实测值:299[M+H]

+

。

步骤2:合成3-((4-(4-甲氧基-4-(甲氧基羰基)环己基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-5-甲基-

1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯

将4-(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)-1-甲氧基环己烷-1-甲酸甲酯(70.5mg,0.236mmol)、3-氨

基-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯(69.8mg,0.354mmol)、二-叔丁基(2',4',6'-三异丙基-

[1,1'-联苯]-2-基)膦(20.0mg,0.2当量)、Pd

2

(dba)

3

(21.6mg,0.1当量)和乙酸钾(70mg,0.71mmol)在氮气下在小瓶中合并,并添加0.98mL

二噁烷。将反应混合物加热至115°C持续2小时,然后冷却至环境温度。将反应混

合物用EtOAc稀释,经由硅藻土过滤,浓缩到硅胶上,并通过硅胶快速柱色谱法(梯度

洗脱,0至100%乙酸乙酯-己烷)纯化所得残余物,得到黄色油状的3-((4-(4-甲氧基-4-

(甲氧基羰基)环己基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯

(48mg,44%)。MS(ES+)C

23

H

33

N

5

O

5

理论值:459;实测值:460[M+H]

+

。

步骤3:合成1-甲氧基-4-(6-甲基-2-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-4-基)环己烷-1-

甲酸

将氢氧化锂一水合物(13mg,0.31mmol)加入到3-((4-(4-甲氧基-4-(甲氧基羰基)环己

基)-6-甲基嘧啶-2-基)氨基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯(47.7mg,0.104mmol)于

THF/MeOH/H

2

O(17:1:1,1.8mL)中的溶液中。将反应混合物加热至60°C并搅拌16小时。然后将反

应混合物冷却至环境温度并浓缩,得到粗制的1-甲氧基-4-(6-甲基-2-((5-甲基-1H-吡

唑-3-基)氨基)嘧啶-4-基)环己烷-1-甲酸(57mg,粗品),其未经任何进一步纯化用于随后

的酰胺偶合中。MS(ES+)C

17

H

23

N

5

O

3

理论值:345;实测值:346[M+H]

+

。

步骤4:合成((1s,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-1-甲氧基-4-(6-

甲基-2-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-4-基)环己烷-1-甲酰胺(化合物149)

使用合成方案1和2中概述的相同程序(酰胺偶合),用PyBOP作为酰胺偶合剂代替

HATU,由1-甲氧基-4-(6-甲基-2-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-4-基)环己烷-1-甲

酸(57mg,0.104mmol)制备标题化合物。产物最初作为非对映异构体混合物(36mg)而

分离,然后将其溶解于6mL甲醇-DCM(1:1)中,并通过SFC(ChiralPakIC-H21×250mm,

含有于CO

2

中的0.25%DEA的40%MeOH,1.0mL注入液,70mL/min)纯化。峰1为不需要的异构

体,并将峰2浓缩,得到白色固体状的(1s,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-

基)乙基)-1-甲氧基-4-(6-甲基-2-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-4-基)环己烷-1-甲

酰胺(13.4mg,24%)。

中间体的合成

实施例7.酮和硼酸酯中间体的合成

A.1-甲氧基-4-氧代环己烷-1-甲酸甲酯

标题化合物如WO2014/130810A1第86页中所述制备。

B.1-乙氧基-4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯

步骤1:合成8-乙氧基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸乙酯

将1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-酮(20.0g,128mmol)于CHBr

3

(3234g,1280mmol)中的溶液冷却至0°C,并且经2.5小时逐滴加入在EtOH(300mL)中

的氢氧化钾(57.5g,1024mmol)。搅拌混合物23小时后,浓缩混合物,并将残余物在

EtOAc与H

2

O之间分配。将有机层用盐水洗涤,经由Na

2

SO

4

干燥,过滤并减压浓缩,得到粗产物,将其通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗

脱,PE:EA=15:1至10:1)纯化,得到标题化合物(18.0g)。

步骤2:合成1-乙氧基-4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯

向8-乙氧基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸乙酯(10g,43mmol)在1,4-二噁烷(250mL)

中的溶液中添加HCl水溶液(6M,92.5mL),并将混合物在环境温度下搅拌23小时。

然后将混合物用H

2

O稀释并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤,经Na

2

SO

4

干燥,过滤并减压浓缩,得到粗残余物,将其通过硅胶快速柱色谱法(PE:EA=15:1)纯化,

得到产物(8.0g)。

1

HNMR(400MHz,DMSO)δ4.20–4.13(m,2H),3.43(q,J=6.9Hz,1H),2.48–2.39(m,1H),2.24–

2.12(m,2H),2.10–2.01(m,1H),1.22(t,J=7.1Hz,2H),1.17(t,J=7.0Hz,2H)。

C.6,6-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯

步骤1:合成2,2-二甲基-4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯

在0°C下,将甲基溴化镁(3M,109.8mL,329.4mmol)的溶液逐滴添加到

CuCN(14.75g,164.7mmol)于乙醚(50mL)中的悬浮液中。将混合物在0°C下搅拌30

分钟,然后冷却至-78°C。接着逐滴添加2-甲基-4-氧代环己-2-烯-1-甲酸乙酯

(10g,54.9mmol)于乙醚(10mL)中的溶液。在-40°C至-20°C下搅拌混合物2小时,然后

温至环境温度并持续16小时。将反应混合物小心地加入到饱和氯化铵溶液中。将

水层用乙醚萃取两次,合并有机层。将合并的有机层用盐水洗涤,经硫酸钠干燥,过滤

并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(PE:EA=10:1)纯化残余物,得到2,2-二甲基-4-氧代

环己烷-1-甲酸乙酯(1.16g)。

步骤2:合成6,6-二甲基-4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯

将2,2-二甲基-4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯(1.16g,5.85mmol)和DIPEA(3.03g,23.4mmol)

溶于无水甲苯(2mL)中并在45°C下加热10分钟。经10分钟逐滴添加在

DCM(20mL)中的三氟甲磺酸酐(6.61g,23.4mmol),并将混合物在45°C下加热2小时。

使混合物冷却至室温,浓缩,用水(60mL)稀释并用DCM(2×40mL)萃取。将有机层用

饱和碳酸氢钠溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤,经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶

快速柱色谱法(梯度洗脱,0至100%乙酸乙酯-石油醚)纯化粗产物,得到6,6-二甲基-4-

(((三氟甲基)磺酰基)氧基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯(1g)。

步骤3:合成6,6-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-

甲酸乙酯

将6,6-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯

(1g,3.03mmol)、4,4,5,5-四甲基-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-

1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(1.15g,4.54mmol)、Pd(dppf)Cl

2

(73.5mg,0.09mmol)和乙酸钾(891mg,9.08mmol)悬浮于1,4-二噁烷(20mL)中。将反应

混合物用氮气冲洗,然后加热至100°C并持续2小时。将混合物冷却至室温,过滤并

浓缩,并通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱,0至100%乙酸乙酯-石油醚)纯化所得的棕

色油状物,得到6,6-二甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯

-1-甲酸乙酯(618mg)。

D.6-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯

使用与上述相同的合成方案,使用2-甲基-4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯作为原料制备6-

甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)环己-3-烯-1-甲酸乙酯。

E.2-甲基-5-氧代四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯

步骤1:合成2-甲基-3,4-二氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯

将丙烯醛(120g,2.14mol)、甲基丙烯酸甲酯(200g,2.00mol)和氢醌(2.2g,20mmol)的混

合物在180°C下于密封钢容器中加热1小时。然后将混合物冷却至环境温度并浓缩。

通过硅胶柱色谱法(梯度洗脱,石油醚:乙酸乙酯=100:1至80:1)纯化残余物,得到浅黄

色油状的2-甲基-3,4-二氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(70g,产率22%)。

1

H-NMR(400MHz,CDCl3):δ6.38(d,J=6.4Hz,1H),4.73-4.70(m,1H),3.76(s,3H),2.25-

2.22(m,1H),1.99-1.96(m,2H),1.79-1.77(m,1H),1.49(s,3H)。

步骤2:合成5-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯

在-5°C下向2-甲基-3,4-二氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(20.0g,128mmol)于无水四氢呋喃

(200mL)中的溶液中逐滴添加硼烷(67mL,1M,在四氢呋喃中)。将反应混合物在0°C

下搅拌3小时。通过TLC监测此反应。通过乙酸钠(10.5g,128mmol)在水(15mL)中

的溶液淬灭混合物。然后将混合物在0°C下缓慢地用30%过氧化氢溶液

(23.6g,208.2mmol)处理并在30°C下搅拌3小时。接着将混合物在饱和亚硫酸钠溶

液与四氢呋喃之间分配。将水层进一步用四氢呋喃(2X)萃取。将合并的有机层用饱

和盐水洗涤,经硫酸钠干燥并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(梯度洗脱,石油醚:乙酸

乙酯=10:1至1:1)纯化残余物,得到浅黄色油状的粗5-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-2-甲

酸甲酯(18g,粗产物),将其直接用于下一步。

步骤3:合成2-甲基-5-氧代四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯

向5-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(18.0g,103mmol)于无水二氯甲烷(200mL)

中的溶液中分批添加PCC(45.0g,209mmol)。在环境温度下搅拌反应混合物直到

TLC显示反应完成。然后添加石油醚(500mL)并过滤混合物。将滤饼用石油醚

(100mL)洗涤,并且真空浓缩滤液,得到浅黄色油状的2-甲基-5-氧代四氢-2H-吡喃-2-

甲酸甲酯(15g,84%产率)。

1

H-NMR(400MHz,CDCl

3

):δ4.25(d,J=17.6Hz,1H),4.07(d,J=17.6Hz,1H),3.81(s,3H),2.52-2.44(m,3H),2.11-

2.04(m,1H),1.53(s,3H)。

实施例8.碘化物中间体的合成

A.1-甲氧基-4-碘代环己烷-1-甲酸甲酯

步骤1:合成1-甲氧基-4-羟基环己烷-1-甲酸甲酯

将1-甲氧基-4-氧代环己烷甲酸甲酯(4.00g,21.5mmol)溶于甲醇(100mL)中并将溶液

冷却至0°C。经20分钟分批加入硼氢化钠(2.03g,53.7mmol)。将反应混合物搅拌30

分钟,然后通过加入饱和NH

4

Cl水溶液使其淬灭。蒸发淬灭的反应混合物以除去MeOH,然后用DCM(3×)萃取含

水悬浮液。将合并的有机层经硫酸钠干燥,过滤并浓缩,得到残余物,通过硅胶快速柱

色谱法(梯度洗脱,5%至100%乙酸乙酯-己烷)纯化该残余物,得到无色油状的1-甲氧

基-4-羟基环己烷-1-甲酸甲酯(2.00g,49.5%)。MS(ES+)C

9

H

16

O

4

理论值:188;实测值:211[M+Na]

+

。

步骤2:合成1-甲氧基-4-碘代环己烷-1-甲酸甲酯

将1-甲氧基-4-羟基环己烷-1-甲酸甲酯(2.00g,10.6mmol)溶于THF(20mL)中并添加咪

唑(723mg,10.6mmol)和三苯基膦(3.34g,12.8mmol)。将混合物冷却至0°C,然后经15

分钟逐滴添加碘(3.24g,12.8mmol)的THF(10mL)溶液。使反应混合物升温至环境温

度,然后搅拌2天,之后将其倾倒在饱和硫代硫酸钠溶液中并用EtOAc萃取。将有机

层经硫酸钠干燥,过滤,浓缩,并将残余物用己烷(40mL,搅拌20分钟)研磨。过滤混合

物,并且蒸发滤液得到残余物,通过硅胶快速柱色谱(梯度洗脱,0至30%乙酸乙酯-己

烷)纯化该残余物,得到淡黄色油状的标题化合物(2.37g,75%)。MS(ES+)C

9

H

15

IO

3

理论值:298;实测值:299[M+H]

+

。

B.1-乙氧基-4-碘代环己烷-1-甲酸乙酯。

如上所述用1-乙氧基-4-氧代环己烷-1-甲酸乙酯作为原料制备标题化合物。C

11

H

19

IO

3

理论值:326;实测值:327[M+H]

+

。

实施例9.胺中间体的合成

A.(S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺。

步骤1:合成1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮

将4-氟-1H-吡唑(4.73g,55mmol)和碳酸钾(17.27g,125mmol)合并,并在N,N-二甲基甲

酰胺(41.7mL)中在敞口密封管中搅拌10分钟,然后添加2-溴-5-乙酰基吡啶

(10g,50mmol)。将反应管密封并在100°C下搅拌20小时。然后将反应混合物冷却

至室温并倒入水(约700mL)中。超声处理混合物并搅拌20分钟,然后通过过滤分离

米色固体,用少量水洗涤并干燥,得到1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮

(9.81g,96%产率)。MS:M+1=206.0。

步骤2:合成(R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺

酰胺

向1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮(9.806g,47.8mmol)在THF(96mL)中的

室温搅拌溶液中添加(R)-(+)-叔丁基亚磺酰胺(5.79g,47.8mmol),然后添加乙醇钛

(IV)(21.8g,96mmol)。将该溶液在75°C下于油浴中搅拌15小时。在下一步之前,将

反应溶液冷却至室温,然后冷却至-78°C外(部温度)。经约55分钟向-78°C溶液中逐

滴添加L-Selectride(143mL1N的THF溶液,143mmol)。在添加期间,观察到一些鼓泡。

然后在添加完成之后在-78°C下搅拌反应物15分钟,然后升温至室温。从冷浴中取

出的样品的LC-MS显示反应完成。将反应物冷却至-50°C并用甲醇(约10mL)缓慢

淬灭,然后倒入水(600mL)中并搅拌。通过过滤除去灰白色沉淀,用乙酸乙酯洗涤。

将滤液用乙酸乙酯(800mL)稀释,分离各层,并且将有机层经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。

通过硅胶色谱法纯化粗产物,得到淡黄色固体状的(R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-

基)吡啶-3-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(10.5g,99%纯度,70.3%收率)。

MS:M+1=311.1。

步骤3:合成(S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺。

将(R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺

(10.53g,33.9mmol))于甲醇(79mmol)和4NHCl/二噁烷(85mL,339mmol)中的溶液搅拌

2.5小时,此时LC-MS显示反应完成。将反应溶液倒入乙醚(300mL)中并形成粘性固

体。用乙酸乙酯(200mL)处理混合物并超声处理。倾析溶剂,并且将粘性固体用更多

乙酸乙酯(约200mL)处理,超声处理并搅拌。大部分粘性固体转化为悬浮液。通过

过滤分离淡黄色固体,用较少量乙酸乙酯洗涤并干燥,得到(S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-

基)吡啶-3-基)乙-1-胺(7.419g,产率78%)。LC-MS证实了高纯度的所需产物。

MS:M+1=207.1。

B.(S)-1-(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙-1-胺。

步骤1:合成1-(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙-1-酮

在环境温度下将氢化钠(60wt%,276mg,6.90mmol)加入到1-(5-氯代吡嗪-2-基)乙酮

(800mg,5.11mmol)和4-氟-1H-吡唑(484mg,5.62mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(6.0mL)

中的混合物中并持续10分钟。然后将反应混合物倒入水(70mL)中并超声处理并搅

拌20分钟。通过过滤分离深红色固体,用少量水洗涤,并干燥,得到1-(5-(4-氟-1H-吡

唑-1-基)吡嗪-2-基)乙-1-酮(919mg,产率95%)。MS:M+1=207。

步骤2:合成(R)-N-((S)-1-(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺

酰胺

向1-(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙-1-酮(4.67g,22.7mmol)在THF(45mL)中的室

温搅拌溶液中添加(R)-(+)-叔丁基亚磺酰胺(2.75g,22.7mmol),然后添加乙醇钛

(IV)(10.3g,45.3mmol)。将该溶液在75°C下于油浴中搅拌20小时。将反应溶液冷却

至室温,然后在下一步之前冷却至-78°C。经50分钟向-78°C溶液中逐滴添加L-

Selectride(50.1mL1N的THF溶液,50.1mmol)。在添加期间,观察到一些鼓泡。添加

完成之后,将反应物搅拌15分钟,然后升温至室温。从冷浴中取出的样品的LC-MS

显示反应完成。将反应物冷却至-60°C,并且用甲醇(1mL)缓慢淬灭,然后倒入水

(100mL)中并搅拌。过滤混合物,将固体用乙酸乙酯进一步洗涤。将滤液用乙酸乙酯

稀释,并且将有机层经硫酸钠干燥,过滤,浓缩,并将所得残余物通过快速柱色谱法(梯

度洗脱,0至100%乙酸乙酯-二氯甲烷)纯化,得到棕色固体状的(R)-N-((S)-1-(5-(4-氟-

1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.04g,14%)。MS:M+1=312。

1

HNMR(400MHz,DMSO-

d6)δ9.12(d,J=1.4Hz,1H),8.73(d,J=4.5Hz,1H),8.59(d,J=1.4Hz,1H),8.03(d,J=4.1Hz,1H),5.

69(d,J=5.7Hz,1H),4.62(p,J=6.8Hz,3H),1.57(d,J=6.9Hz,3H),1.12(s,9H)。

步骤3:合成(S)-1-(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙-1-胺

将(R)-N-((S)-1-(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺

(1.04g,3.34mmol)于甲醇(7.8mL)和4NHCl/二噁烷(8.34mL,33.4mmol)中的溶液在环

境温度下搅拌1.5小时。将反应混合物倒入乙醚(100mL)中,并且通过过滤分离浅米

色固体,得到(S)-1-(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)乙-1-胺(689mg,产率85%)。

MS:M+1=208。

C.(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)甲胺

步骤1:合成5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-甲腈

向5-氯代吡嗪-2-甲腈(280mg,2.0mmol)于DMF中的溶液中添加4-氟-1H-吡唑

(170mg,2.0mmol)和乙酸钾(395mg,4.0mmol)。将混合物在100°C下搅拌4小时,然后

冷却至20°C,倒入盐水(25mL)中,并用乙酸乙酯萃取。将有机层经硫酸钠干燥,浓缩,

并通过柱色谱法(己烷:乙酸乙酯=5:1)纯化,得到5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-甲腈

(310mg,82%)。通过LC-MS证实结构。

步骤2:合成(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)甲胺

在0°C下将5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-甲腈(190mg,1.0mmol)和NiCl

2

(12mg,0.1mmol)于MeOH(5mL)中的混合物中添加NaBH

4

(380mg,10mmol)。在0°C下搅拌混合物2小时,用NH

4

Cl水溶液淬灭,并通过HPLC纯化,得到(5-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡嗪-2-基)甲胺(160mg,

产率82%)。通过LC-MS证实结构。

D.(6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)甲胺

步骤1:合成6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)烟腈

向6-氯代烟腈(300mg,2.2mmol)于DMF(10mL)中的溶液中添加3,5-二甲基-1H-吡唑

(210mg,2.2mmol)和Cs

2

CO

3

(1.4g,4.4mmol),并且在90°C下搅拌混合物16小时。然后用H

2

O(25mL)稀释混合物并过滤。将固体用水洗涤并真空干燥,得到6-(3,5-二甲基-1H-吡

唑-1-基)烟腈(320mg,74.6%)。

步骤2:合成((6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯

向于MeOH(10mL)中的6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)烟腈(300mg,1.5mmol)中添加

NiCl

2

(19mg,0.15mmol)、(Boc)

2

O(654mg,3.0mmol)和NaBH

4

(142mg,3.8mmol),并将混合物在环境温度下搅拌3小时。添加饱和氯化铵水溶液,并

在真空下除去MeOH。将含水悬浮液用乙酸乙酯分配,并将有机层用饱和碳酸氢钠

溶液(2×50mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤并真空浓缩,得到450mg目标化合物,将

其在无进一步纯化下用于下一步中。

步骤3:合成(6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)甲胺

将HCl在二噁烷中的溶液(4.0M,10mL)加入到化合物((6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)

吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(450mg)中,并将混合物搅拌2小时。然后将混合物

减压浓缩,得到浅棕色固体状的标题化合物(350mg),其在无进一步纯化下继续使用。

1

HNMR(400MHz,DMSO-

d6)δ8.51(d,J=2.1Hz,1H),8.34(s,3H),8.03(dd,J=8.5,2.4Hz,1H),7.87(d,J=8.5Hz,1H),6.14(s,

1H),4.12(q,J=5.7Hz,2H),2.59(s,3H),2.21(s,3H)。

E.(6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)甲胺

步骤1:合成6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)烟腈

向6-氯代烟腈(300mg,2.2mmol)于DMF(10mL)中的溶液中添加4-氯-1H-吡唑

(227mg,2.2mmol)和Cs

2

CO

3

(1.4g,4.4mmol),并在90°C下搅拌混合物16小时。然后用H

2

O(25mL)稀释混合物并过滤。将固体用H

2

O洗涤并在真空下干燥,得到6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)烟腈(380mg,84%),其在不进一步

纯化下用于下一步。

步骤2:合成((6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯

向于MeOH(10mL)中的6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)烟腈(350mg,1.7mmol)中添加NiCl

2

(19mg,0.17mmol)、(Boc)

2

O(741mg,3.4mmol)和NaBH

4

(163mg,4.3mmol),并将混合物在环境温度下搅拌3小时。添加饱和NH

4

Cl水溶液,并在真空下除去MeOH。然后将含水悬浮液用EtOAc分配,并将有机层用

饱和碳酸氢钠溶液(2×50mL)洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤并真空浓缩,得到480mg

标题化合物,将其在无进一步纯化下用于下一步。

步骤3:合成(6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)甲胺

将HCl在二噁烷(4.0M,10mL)中的溶液在环境温度下添加到((6-(4-氯-1H-吡唑-1-基)

吡啶-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(450mg,1.5mmol)中。将混合物搅拌2小时,然后减

压浓缩,得到浅棕色固体状的标题化合物(290mg),将其在无进一步纯化下使用。

MS:M+1=209。

F.(R)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺

步骤1-3:

(R)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺

使用与制备此化合物的S对映异构体相同的工序,由1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-

3-基)乙-1-酮制备标题化合物,例外的是用(S)-(-)-叔丁基亚磺酰胺代替(R)-(-)-叔丁基

亚磺酰胺作为手性助剂。MS(ES+)C

10

H

11

FN

4

理论值:206;实测值:207[M+H]

+

。

下面指出了可用于制备本文公开的化合物的合成方案。下面还示出了针对本文公开

的化合物获得的NMR和LCMS数据。

实施例10:化合物的生物化学活性的测量

为了评估化合物对所关注的相关激酶的活性,使用CaliperLifeSciences电泳迁移率变

动技术平台。将荧光标记的底物肽在激酶和ATP存在下孵育,使得反射比例的肽被

磷酸化。在反应结束时,使磷酸化(产物)和非磷酸化(底物)肽的混合物在施加的电位

差下通过CaliperEZReader2的微流体系统。产物肽上磷酸基团的存在提供了底物肽

之间质量和电荷的差异,由此造成样品中底物与产物汇集物的分离。当汇集物通过

仪器中的LEDS时,这些汇集物将被检测并解析为单独的峰。这些峰之间的比率因

此反映了在那些条件下在该孔中该浓度下的化学物质的活性。

下的RET野生型测定

在384孔平板的每个孔中,将7.5nM-10nM野生型RET(ProQinase1090-0000-1)在含

有1μMCSKtide(FITC-AHA-KKKKDDIYFFFG-NH2)和25μMATP的总共12.5μL缓

冲液(100mMHEPESpH7.5、0.015%BriJ35、10mMMgCl

2

、1mMDTT)中在25°C下在存在或不存在给药浓度系列的化合物(1%DMSO最终浓

度)下孵育120分钟。通过加入70μL终止缓冲液(100mMHEPESpH7.5、

0.015%Brij35、35mMEDTA和0.2%包被试剂3(CaliperLifesciences))来终止反应。

然后在CaliperEZReader2上读取平板(方案设定:-1.7psi,上游电压-500,下游电压-3000,

后样品sip35s)。将数据归一化为0%和100%抑制对照并且使用CORELIMS中的4

参数拟合计算IC

50

。

下的RET

V804L看门突变体测定

在384孔平板的每个孔中,将7.5nM-10nM突变RET(ProQinase1096-0000-1)在25°C

下在含有1μMCSKtide(FITC-AHA-KKKKDDIYFFFG-NH2)和10μMATP的总共

12.5μL缓冲液(100mMHEPESpH7.5、0.015%BriJ35、10mMMgCl2、1mMDTT)中在

存在或不存在给药浓度系列的化合物(1%DMSO最终浓度)下孵育120分钟。通过

加入70μL终止缓冲液(100mMHEPESpH7.5、0.015%Brij35、35mMEDTA和0.2%

包被试剂3(CaliperLifesciences))来终止反应。然后在CaliperEZReader2上读取平板

(方案设定:-1.7psi,上游电压-500,下游电压-3000,后样品sip35s)。将数据归一化为0%

和100%抑制对照并且使用CORELIMS中的4参数拟合计算IC

50

。

在下表中,使用以下名称:<10.00nM=A;10.01-100.0nM=B;且>100nM=C。

以引用的方式并入

本文提及的所有出版物和专利据此通过引用整体并入本文,如同每个单独的出版物

或专利具体地和单独地表示为通过引用并入本文。

等效方案

本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实

施方案的许多等效方案。此类等效方案意图包含于下列权利要求中。