最详细的WesternBlot过程步骤详解

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最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t

过程步骤详解

Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-

STT18】

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然

后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行

检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:

一、原理

二、分类

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

ECF

iv.底物DAB呈色

三、主要试剂

四、主要步骤

五、实验常见的问题指南

1.参考书推荐

2.针对样品的常见问题

3.抗体

4.滤纸、胶和膜的问题

的相关疑问

6.染色的选择

7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索

10.方法的介绍

11.结果分析

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用

的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，

“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相

载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白

质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体

上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同

位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳

分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋

白水平的表达。

二、分类

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验

条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP

标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使

胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂

1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解

双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，

N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺

1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实

PH不得超过，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不

得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)，1mlH2O去离子水配

制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:LTris-HCL:和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释

到100ml终体积。过滤后40C保存。

4、浓缩胶缓冲液:LTris-HCL:溶于40mlH2O中，用约48ml

1mol/L HCL调至加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两

种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用。

5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形

成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。

10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去

离子水配制数ml，临用前配制.

6、SDS-PAGE加样缓冲液: L Tris缓冲液8ml，甘油，10%SDS ，

巯基乙醇，%溴酚蓝，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白

质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋

白量100μg。

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水

溶

解至1000ml，得L L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。

8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取甘氨酸、碱、 SDS，

并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸

30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。

使

用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%(w/v)。

11、NaN3 % 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液

(PBS)。

12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL，

500mmol/LnaCl。

13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

17、100mmol/LTris-HCL。

18、100mmol/L NaCl。

19、50mmol/LTris-HCL，5mmol/L EDTA。

（可以参看分子克隆）

四、主要步骤

主要包括以下4个基本步骤

1.样品制备

原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋

白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制

备方法参阅相关文献。

1．培养细胞或药物处理。

2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。

3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2

plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。

4．超声 10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。

5．煮沸样品5 minutes。

6．离心 12000g, 5 min，取上清。

7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 胶 ( 10 cm x 10

cm)电泳。

如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107

cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管

中，在振荡器上混匀4～15min， 14000g离心15min

（ 4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上

清

中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需

设置内或外参照，通常用beta-actin。

注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，

可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采

用更敏感的检测方法。

2.电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）

3.转膜

杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交

方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径

和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜

(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离

子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作

用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的

蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔

径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合

就越牢固。通常用μm和μm两种规格的NC膜。大于20kD 的蛋白

可用μm的膜，小于20kD的蛋白就要用μm的膜了，如用μm 的膜

就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白

亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF

膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。

蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者

操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液

少。以下为槽式湿转的操作步骤。

1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。

注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散

出胶。

2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡

10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。

3. 装配转移三明治：海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好

后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。

4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转

移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为）。注意：应再次检查三

明治和电极是否装配正确，电源是否接通。

5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜

4.免疫杂交与显色

1．用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。

2．置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。

3．15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或 4°C过夜，缓慢摇

动。

5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）

标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。

7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

8．15 ml TBS洗1次。

9．蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。

注意事项：

1．操作中戴手套，不要用手触膜。

2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。

3．如检测小于20kD的蛋白应用μm的膜，并可省略转移时的平

衡步骤。

4．某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用% BSA代替

Tween-20。

5．关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相

互作用，掩盖抗体结合能力；~3% BSA in PBS：低的内源性交叉反应

性。

6．如用0. 1% Tween 20、% NaN 3 in PBS or TBS作封闭剂和

抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。

如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。

五、实验常见的问题指南

根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲

目模仿！）：

1.参考书推荐

A.对初学者看什么资料比较好

解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory

manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。

2.针对样品的常见问题

B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western

Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一

抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个

santa cloz的一抗仍不行。是什么原因蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗

解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样

品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗

浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多

加几中种蛋白酶抑制剂。

E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗

解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么

解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，

这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时

经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的

孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决

解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少

电流延长时间，多加5－10％甲醇。

H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓

度多大合适积层胶的浓度又该用多少这么大分子量的蛋白容易作

Western Blot吗

解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％， Stacking Gel ％。

I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量如果需要加大上样

量使原来弱的条带能看清楚。

解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分

小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少

了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试的

comb。

J.蛋白变性后可以存放多久

解答：－ 80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水

解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用%，

但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何

解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白

在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

L.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗

体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否

要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢好像有资料说脱脂奶粉会影响亲

和素生物素的生成，是吗

解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ

代替应该好一点．

M.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的

表达量有关系吗

解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋

白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间

长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多

一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体

好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合

Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。N.做组织

样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗还有，您用过大牛血

清做封闭剂吗浓度如何效果是不是比BSA好一点

解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，

离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要

分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注

意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭

剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是

不错的选择。

O.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注

意什么呢

解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选

择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照

（否则出现杂带不知道如何分析）。

P.有什么方法可以提高上样量

解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。

Q.我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提

取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以

的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大

解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可

以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就

可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，

也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求

解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量

的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关

系，尽量多上就行了，但是不要超过μg/mm2。

S.一抗，二抗的比例是否重要

解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特

异的本底。

3.抗体

做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何

要求

解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP

标记的二抗。

U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做

预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢我用的ELL+plus试剂盒

显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天

才看的到结果了。

解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度

也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，

转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具

体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是

半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot

时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时

就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可

以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几

次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是

5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时

间，只会节省你的时间！

V.免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗

解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又

称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋

白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受

蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的

是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时

用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于

免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。

（限于单抗）

n Blot 中抗体的重复应用问题

解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较

珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，

避免反复冻融。

4.滤纸、胶和膜的问题

膜 PVDF膜 尼龙膜怎样鉴别

解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤

维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于

二者之间。

就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μ

g/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA

和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能

力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。

就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部

分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作

用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于

蛋白印迹。

就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜

较强。

就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子

可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重

复使用。

Y.在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基

团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加

甲醇也是这个目的。

Z.检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗

解答：可以。

AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点

样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么

解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和

电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB.我

想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液

解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时

又可以让磷酸化酶失活。

CC.采用tank system有什么讲究

解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），

如 28V 14－16hrs。

DD.做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而

WESTEN却不能

解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做

Western Blot和IHC。

EE.膜一般要如何处理

解答：一般用甲醇泡泡就可以了。

FF.如果是6×8转印膜，要加多少一抗

解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，

但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

GG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

解答：无要求。

HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢是有的成分不

对吗解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜

膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分

被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问

题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用

好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成