滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响

昆明医科大学学报　2021，42 （4 ） ：8~12

DOI: 10.12259/.2095-610X.S20210402

CN 53 − 1221/R

Journal of Kunming Medical University

滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响

皮　娜

1）

，何　琴

1）

，钟　燕

1）

，靳　璇

1）

，朱振东

2）

，张　旋

1）

（1）昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明　650500；

2）云南省第三人民医院/大理大学第二附属医院老年病科，云南 昆明　650011）

[ 摘要] 目的　研究滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响。方法　气管滴注博莱

霉素（5 mg/kg ）制备昆明小鼠肺纤维化模型，造模后灌胃给予低、中、高剂量（50、100、200 mg/kg）的滇龙胆草，

每日给药1次，设比非尼酮为阳性对照。在建模后第28天，取肺组织进行检测，肉眼观察肺组织大体病理改

变，Masson染色观察肺组织纤维化程度；采用Western blot检测肺组织中NF-κB和CTGF蛋白的表达。

结果　与模型组比较，不同剂量的滇龙胆草组和阳性药物比非尼酮组小鼠肺组织胶原沉积明显减少。与模型组

比较，不同剂量的滇龙胆草组和阳性药物比非尼酮组小鼠肺组织NF-κB和CTGF蛋白表达明显下调，差异有

统计学意义（

P

< 0.05）。结论　滇龙胆草具有抗肺纤维化作用，其机制与下调NF-κB和CTGF蛋白表达，减轻

肺组织炎症和胶原沉积有关。

[ 关键词] 肺纤维化； 滇龙胆草； 核因子-κB； 结缔组织生长因子

[ 中图分类号] R91 [文 献标志码] A [文 章编号] 2095 − 610X（2021）04 − 0008 − 05

Effect of Gentiana Rigescens Franch on Expression of NF - κ

B and CTGF in Lung Tissue of Mice with

Pulmonary Fibrosis

PI Na

1）

，HE Qin

1）

，ZHONG Yan

1）

，JIN Xuan

1）

，ZHU Zhen-dong

2）

，ZHANG Xuan

1）

（1） School of Pharmaceutical Sciences & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural

Products，Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650500; 2） Dept. of Geriatrics，The

3rd People’s Hospital of Yunnan Province，The 2nd Affiliated Hospital of

Dali University，Kunming Yunnan 650011，China）

［Abstract］ Objective　To study the effect of Gentiana rigescens Franch on the protein expression of NF -

κ B and CTGF in lung tissue of mice with pulmonary fibrosis. Methods　The model of pulmonary fibrosis in

Kunming mice was established by intratracheal instillation of bleomycin （5 mg·kg

-1

）. Low，medium and high

doses （50，100，200 mg·kg

-1

） of Gentiana rigescens Franch were administered intragastrically once a day.

Pirfenidone was used as positive control. The mice were killed on the 28th day after modeling，and the lung tissues

were taken for detection. Gross pathological changes of lung tissue were observed by naked eyes. Masson staining was

used to observe the degree of pulmonary fibrosis. Western blot was used to detect the expression of NF - κ B and

CTGF in lung tissue. Results　Compared with the model group，the collagen deposition in lung tissue of mice was

significantly reduced in different doses of Gentiana rigescens group and positive drug Pirfenidone group. Compared

with the model group，the protein expression of NF - κ B and CTGF in lung tissue of mice were significantly down-

[收稿日期] 2020 − 12 − 07

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81460565）；云南省应用基础研究面上基金资助项目（2014FB152）；云南省地

方本科高校应用基础研究联合专项重点基金资助项目（2017FH001-009）

[作者简介] 皮娜（1995～），女，云南文山人，在读硕士研究生，主要从事抗炎免疫药理研究工作；何琴与皮娜对本文

有同等贡献。

[通信作者] 朱振东，E-mail：**********************；张旋，E-mail：****************

第 4 期

皮 娜， 等．滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响9

regulated in different doses of Gentiana rigescens group and positive drug bifidone group （

P

< 0.05）.

Conclusion　Gentiana rigescens Franch has anti-pulmonary fibrotic effect，the anti-fibrotic mechanism is related

to inhibiting lung inflammation and collagen deposition througth down-regulating the protein expression of NF - κ B

and CTGF.

［Key words］ Pulmonary fibrosis；Gentiana rigescens franch；Nulcear factor-κB；Connective tissue

growth factor

肺纤维化是各种肺内外致病因素所致的间质

性肺疾病，其本质是肺组织结构破坏和修复过度

导致肺组织重构。肺纤维化严重危害患者健康，

可导致患者肺功能进行性衰退，最终导致呼吸衰

竭而死亡

[1−2]

。近年来肺纤维化的发病率呈上升

趋势，而且治疗效果不佳，患者预后差。虽然

2014年美国FDA同时批准了2个治疗肺纤维化

的新药：吡非尼酮和尼达尼布

[3]

。但是这2种新

药长期服用会引起一系列不良反应，而且价格昂

贵，普通患者难以承受。因此，急需研发高效、

低毒、经济的抗肺纤维化新药。

滇龙胆草（

Gentiana rigescens Hemsl.

）

为龙胆科龙胆属植物，别名还有坚龙胆、苦胆草、

小秦艽，主产于云南，是云南道地中药材，在四

川、贵州、广西、湖南等地也有分布

[4]

。龙胆属

植物中含有多种活性成分，如环烯醚萜、黄酮类、

三萜类等化合物，具有抗炎、镇痛、保肝、抗肿

瘤、抗病毒等多种药理活性

[5]

。研究发现来源于

该植物的苦胆草能够减轻吸虫引起的肝纤维化

[6]

，

还能够减轻博莱霉素引起的大鼠肺纤维化程度

[7]

，

但其抗纤维化作用机制不清楚。因此，本研究在

博莱霉素制备小鼠肺纤维化模型上进一步观察滇

龙胆草的抗肺纤维化作用，并初步探讨其作用

机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性昆明种小鼠60只，5～7周龄，

体重18～22 g，由昆明医科大学实验动物学部提

供，实验动物饲养许可证号：SCSK（滇K2015-

0002）。

1.2 药物与试剂

滇龙胆草购自昆明市螺蛳湾中药材市场，并

经昆明医科大学药学院陆露教授鉴定；吡非尼酮

（pirfenidone，PFD），购自大连美仑生物技术有限

公司；注射用盐酸博莱霉素（bleomycin，BLM），

购自海正辉瑞制药有限公司；BCA蛋白浓度测定

试剂盒（增强型），SDS-PAGE凝胶快速配制试剂

盒，购于碧云天；Masson三色染色试剂盒，购自

福州迈新生物技术有限公司；NF-ĸBp65多克隆

抗体和CTGF多克隆抗体购自美国CST公司，

GAPDH Rabit Polyclonal antibody，HRP-偶联Goat

Anti-Rabbit IgG（H + L），购自美国Proteintech公

司；Bio-rad Clarity Western ECL化学发光底

物，购自美国Bio-rad公司；彩虹180广谱蛋白

Marker（11-180KD），购自北京索莱宝生物科技有

限公司。

1.3 动物分组与处理

小鼠适应性饲养1周，开始实验。小鼠随

机分为6组，正常对照组（NS组），模型组

（Model组），吡非尼酮组（PFD组），滇龙胆草低、

中、高剂量组（Gen50、Gen100、Gen200组），每

组10只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，暴

露气管，NS组一次性气管内滴注无菌生理盐水，

其余各组一次性气管内滴注博莱霉素5 mg/kg ，

滴注后立即将小鼠直立旋转，使博莱霉素溶液或

生理盐水均匀分布于肺内。从造模当天开始，滇

龙胆草低、中、高剂量组分别灌胃给予50、100、

200 mg/kg滇龙胆草0.5%羧甲基纤维素钠溶液，

每日给药1次；NS组和Model组小鼠灌胃给予相

应体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液；PFD组灌胃

给予50 mg/kg吡非尼酮。在给药第28天，麻

醉处死小鼠，收集肺组织标本，Masson染色及

Western blot检测。

1.4 小鼠行为学观察

观察小鼠呼吸、活动及饮食情况，毛发颜色

变化。

1.5 病理组织学观察

肉眼观察肺组织大体病理改变，并取小鼠左

肺，用10%中性福尔马林固定液固定24 h后，

不同浓度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋组织，

切片，进行Masson染色。切片常规烤片，二甲苯

脱蜡，透明，不同浓度乙醇脱水，丽春红品红染

色液染色，磷钼酸溶液染色，苯胺蓝染色液染色，

弱酸洗涤，乙醇常规脱水，二甲苯透明，中性树

10昆明医科大学学报

第 42 卷

胶封片，晾干，镜检观察，并评测肺组织胶原增

殖程度变化。

1.6 Western blot检测肺组织NF-κB和CTGF

蛋白表达

取小鼠肺组织100 mg，剪碎，加入蛋白裂解

液裂解，匀浆，离心收集上清液，采用BCA试剂

盒进行蛋白定量检测。取28 µg蛋白经十二烷基

硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋

白组分后，转印蛋白于PVDF膜上。NF-κB

p65（1∶1

000）、CTGF（1∶1

000）、GAPDH（1∶

2

500）一抗4 ℃过夜，TBST洗涤。加入山羊抗兔

IgG-HRP二抗（1∶5

000）室温孵育2 h，TBST洗

涤，ECL液显影。以GAPDH为内参蛋白，以NF-

κB p65、CTGF蛋白与GAPDH蛋白的灰度值之

比定量分析蛋白相对表达水平。

若方差不齐，则采用多样本比较的秩和检验

（Kruskal-Wallis法），

P

< 0.05为差异有统计学

意义。

2 结果

2.1 一般情况

正常对照组小鼠饮食状况良好、毛发有光泽

且顺滑、活动正常、呼吸平稳。模型组小鼠安静

少动、精神萎靡、毛发粗糙无光泽，其余组无可

见明显变化。

2.2 肺组织病理学变化

2.2.1 肺组织大体形态变化　由小鼠肺组织标本

可见正常对照组肺组织呈粉红色且颜色均匀，表

面光泽且组织水肿不明显；模型组肺组织可见斑

点状出血，组织出现大量水肿；与模型组比较，

滇龙胆草组和吡非尼酮组肺组织均显著好转，表

面光泽，水肿减轻，无可见出血点。见图1（A~F）。

1.7 统计学处理

采用SPSS22.0进行统计学处理，计量资料服

¯±s

）表示，采用从正态分布的以均数±标准差（

x

单因素方差分析方法，组间差别采用LSD检验。

ABCDEF

图 1 肺组织大体标本

Fig. 1 Gross specimen of lung tissue

A：NS正常对照组；B：Model模型组；C：PFD吡非尼酮组；D：Gen50滇龙胆草低剂量组；E：Gen100滇龙胆草中剂量

组；F：Gen200滇龙胆草高剂量组。

2.2.2 肺组织胶原沉积观察　正常对照组小鼠肺

组织肺泡结构较完整、清晰，未见肺泡壁增厚，

肺泡间有少量胶原；模型组小鼠肺组织结构破

坏严重，其间可见纤维组织成条索样、斑片状

分布，在肺间质及支气管周围可见大量纤维组

织增生和胶原沉积；与模型组比较，滇龙胆草

组和吡非尼酮组小鼠组织纤维化上起到明显减

轻。见图2（A~F）。

ABCDEF

图 2 肺组织病理形态学改变（Masson染色，×200）

Fig. 2 The path morphological changes of lung tissues （Masson staining，×200）

A：NS正常对照组；B：Model模型组；C：PFD吡非尼酮组；D：Gen50滇龙胆草低剂量组；E：Gen100滇龙胆草中剂量

组；F：Gen200滇龙胆草高剂量组。

2.3 肺组织NF-κB和CTGF蛋白含量

与正常对照组比较，模型组NF-κB p65和

CTGF蛋白的表达明显增加（

P

< 0.001）；与模型组

比较，滇龙胆草各剂量组均能显著降低肺组织中

第 4 期

皮 娜， 等．滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响11

NF-κB p65和CTGF蛋白的相对表达量（

P

< 0.05），

对于CTGF蛋白表达情况，滇龙胆草高剂量组与

吡非尼酮组相当（

P

> 0.05），对于NF-κB p65蛋

白表达，滇龙胆草各剂量组与吡非尼酮组比较，

差异无统计学意义（

P

> 0.05）。结果表明，滇龙胆

草可显著下调肺纤维化小鼠肺组织中NF-κB p65

和CTGF蛋白的表达。见图3（A~C）。

1.5

***

**###

1.5

N

F

-

κ

B

p

6

5

/

G

A

P

D

H

(

2

8

d

)

***

1.0

C

T

G

F

/

G

A

P

D

H

(

2

8

d

)

***#

***##

###

**###

1.0

###

###

###

0.50.5

0

NSModelPFDGen50Gen100Gen200

A

0

NSModelPFD

B

Gen50Gen100Gen200

NF-κB p65

CTGF

GAPDH

NSModelPFD

65 KDa

36 KDa

36 KDa

C

Gen50Gen100Gen200

图 3 肺组织NF-ĸB p65和CTGF蛋白表达

Fig. 3 Expression of NF-κB p65 and CTGF protein in lung tissue

A：NF-ĸB p65蛋白相对表达量；B：CTGF蛋白相对表达量；C：NF-κB p65 和CTGF蛋白印迹图

与NS组相比，

**

P

< 0.01，

***

P

< 0.001；与Model组相比，

#

P

< 0.05，

##

P

< 0.01，

###

P

< 0.001。

肺组织NF-κB表达明显上调

[13−15]

。本研究发现，

3 讨论

肺纤维化的主要病理特征为早期肺泡上皮细

胞损伤、凋亡和继发的肺泡炎、后期肺组织异常

修复、重构引起大量成纤维细胞增殖分化、胶原

纤维过度沉积、继而导致正常肺结构破坏

[8−9]

。

本研究发现，滇龙胆草能明显减轻肺纤维化小鼠

肺组织炎症和胶原纤维沉积程度，提示滇龙胆草

可从炎症和纤维化两方面减轻肺纤维化。

肺纤维化发病机制复杂，涉及许多炎症和纤

维化细胞因子及信号通路。炎症反应与肺纤维化

密切相关，肺纤维化早期改变以肺泡上皮损伤和

炎症反应为主。核因子-κB（nuclear factor κappa-

B，NF-κB）是一类具有多向调节作用的转录调控

因子，在炎症反应、免疫应答、细胞分化和增殖、

细胞凋亡等病理生理过程中发挥了重要作用

[10−11]

。

NF-κB可调节多种炎症细胞因子的表达，还可

调节纤维化过程中的Th2型免疫反应，促进Th2

细胞因子过表达

[12]

。研究发现，发生肺纤维化时，

模型组小鼠肺组织NF-κB表达明显升高，不同

剂量滇龙胆草组小鼠肺组织NF-κB表达明显下

调，提示滇龙胆草可能通过抑制NF-κB信号通

路减轻炎症反应。

结缔组织生长因子（connective tissue growth

factor，CTGF）参与了许多生理过程，如细胞增殖、

分化、粘附，还参与了多种病理过程，如肿瘤发

生发展和组织纤维化过程。CTGF的过表达可以

导致细胞外基质的大量生成和肌成纤维细胞的增

殖分化

[16−17]

。研究发现，CTGF过表达参与了肺

纤维化的发生发展过程

[18−19]

。本研究发现，模型

组小鼠肺组织CTGF表达明显升高，不同剂量滇

龙胆草组小鼠肺组织CTGF表达明显下调，提示

滇龙胆草可能通过抑制CTGF抑制肌成纤维细胞

增殖分化和细胞外基质沉积。

综上所述，滇龙胆草能够减轻博来霉素诱导

的小鼠肺纤维化程度，其抗肺纤维化作用机制与

下调NF-κB和CTGF蛋白表达，抑制炎症反应

和细胞外基质沉积有关。

12昆明医科大学学报

第 42 卷

［10］Lalle G，Twardowski J，Grinberg-Bleyer Y. NF-κB in

Cancer Immunity：Friend or Foe[J]. Cells，2021，10（2）：

[ 参考文献 ]

［1］Lederer D J，Martinez F J. Idiopathic Pulmonary

355.

［11］Zhang Q，Lenardo M J，Baltimore D. 30 Years of NF-κB：

A Blossoming of Relevance to Human Pathobiology[J].

Cell，2017，168（1-2）：37-57.

［12］Chang X，Zhu A，Liu F，et al. Role of NF-κB activation

Fibrosis[J]. N Engl J Med，2018，378（19）：1811-1823.

［2］Sköld C M，Bendstrup E，Myllärniemi M，et al. Treatment

of idiopathic pulmonary fibrosis：A position paper from a

nordic expert group[J]. J Intern Med，2017，281（2）：149-

166.

［3］Sathiyamoorthy G，Sehgal S，Ashton R W. Pirfenidone and

nintedanib for treatment of idiopathic pulmonary

fibrosis[J]. South Med J，2017，110（6）：393-398.

［4］张金渝，沈涛，杨维泽，等. 云南道地药材滇龙胆资源调

查与评价[J]. 植物遗传资源学报，2012，13（05）：890-

895.

［5］潘旭，朱鹤云，张昌浩，等. 龙胆化学成分和药理作用研

究进展[J]. 吉林医药学院学报，2020，41（02）：150-

151.

［6］屈朝霞，马朝东，王文林. 苦胆草对斯氏狸殖吸虫致大

鼠肝纤维化中TIMP-1表达的影响[J]. 江苏大学学报（

医学版），2010，20（05）：389-391.

［7］王应霞，张丽，张旋，等. 苦胆草对博莱霉素致大鼠肺纤

维化的防治作用[J]. 昆明医科大学学报，2016，37（05）：

38-41.

［8］Knudsen L，Ruppert C，Ochs M. Tissue remodelling in

pulmonary fibrosis[J]. Cell Tissue Res.，2017，367（3）：

607-626.

［9］Meyer K C. Pulmonary fibrosis，part I：epidemiology，

pathogenesis，and diagnosis[J]. Expert Rev Respir Med，

2017，11（5）：343-359.

and Th1/Th2 imbalance in pulmonary toxicity induced by

nano NiO[J]. Environ Toxicol，2017，32（4）：1354-1362.

13］Peng L，Wen L，Shi Q F，et al. Scutellarin ameliorates pul-

monary fibrosis through inhibiting NF-κB/NLRP3-medi-

ated epithelial-mesenchymal transition and inflamma-

tion[J]. Cell Death Dis，2020，11（11）：978.

14］石勤业，郭剑，徐建红. 核转录因子κB及其抑制因子

研究[J]. 医学信息，2020，33（22）：45-47.

15］王妍妮，王昌明. 肿瘤坏死因子α诱导核转录因子κB

信号通路在特发性肺纤维化中的作用机制[J]. 国际呼

吸杂志，2014，34（24）：1886-1889.

16］Ma T，Dong L J，Du X L，et al. Research progress on the

role of connective tissue growth factor in fibrosis of diabet-

ic retinopathy[J]. Int J Ophthalmol，2018，11（9）：1550-

1554.

17］Ramazani Y，Knops N，Elmonem M A，et al. Connective

tissue growth factor（CTGF）from basics to clinics[J]. Mat-

rix Biol，2018，69（3）：44-66.

18］邹梦林，胡星星，张铭杨，等. ERK1/2信号通过钙蛋白

酶调控结缔组织生长因子参与肺纤维化的形成[J]. 武

汉大学学报（医学版），2020，41（5）：720-724.

19］梁瑞娟. 雾化吸入布地奈德对肺纤维化大鼠肺组织

TGF-β和CTGF表达的影响研究[J]. 北方药学，2018，

15（3）：158-159.

［

［

［

［

［

［

［