admin 管理员组文章数量: 1086019
2024年12月29日发(作者：vbse实训心得体会人力资源)
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
htpp://
EASYspin 组织/细胞RNA快速提取试剂盒
目录号：RN07
目录编号
RN0702
适用范围：
适用于快速提取各种细胞组织总RNA
试剂盒组成、储存、稳定性：
保存
室温
室温
室温
室温
室温
室温
包装单位
50次
试剂盒组成
裂解液RLT
去蛋白液RW1
漂洗液RW
RNase-free H
2
O
70%乙醇
RNase-free
吸附柱RA和收集管
50次
50 ml
40 ml
10ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
10 ml
9ml RNase-free H
2
O
第一次使用前按说明加指定量乙醇
50套
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项：
1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直
接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此
运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
- 1 -
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
htpp://
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及
时盖紧盖子。
1.
注意事项
所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，
如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.
3.
需要自备乙醇，一次性注射器，研钵。
裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾
染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4.
1)
2)
3)
预防RNase 污染，应注意以下几方面：
经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不
含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5
M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终
浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
5. 关于DNA 的微量残留：
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本
公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择
了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留
（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的
mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时：
- 2 -
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
htpp://
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与
扩增反应。
2)
3)
选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处
理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我
们索取具体操作说明书。
6. RNA 纯度及浓度检测：
完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电
泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，
电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和
2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大
rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失
表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，
OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在2.1-2.2 之间（100%纯的RNA比值一
般是2.2左右，很多公司无法达到这个标准，所以1.9-2.0就凑合用了，但是我们
的产品标准一般可以达到2.1-2.2）。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值
影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280
读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示
RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水
将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA
浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
- 3 -
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
htpp://
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
1. 组织培养细胞
a. 收集<10
7
悬浮细胞到一个1.5ml离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接
裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b. 13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸
弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入350μl（<5x10
6
细胞）或者600μl
（5x10
6
-1x10
7
细胞）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
d. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直
到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产
量。
e. 接操作步骤项下3。
2. 动物组织（例如鼠肝脑）
a. 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350μl(<20mg组织)或者
600μl(20-30mg组织)的裂解液RLT后电动彻底匀浆20-40秒。
b. 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)
转入装有350μl/600μl组织裂解液RLT的1.5ml离心管中, 用手剧烈振荡20秒，
充分裂解。用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次
或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高
产量。
c. 将匀浆后裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或
- 4 -
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
htpp://
者不溶物, 将裂解物上清小心转到一个新离心管。
d. 接操作步骤项下3。
3. 较精确估计裂解物(上清)体积,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水
乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
4. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附
柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，弃掉废液。
5. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
6. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，
弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
7. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免
漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
8. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的
中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量），
室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
9. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤8, 合并两次洗脱
液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高
15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
- 5 -
版权声明：本文标题：EASYspin 组织 细胞RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://www.roclinux.cn/p/1735494945a1672220.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
发表评论