admin 管理员组文章数量: 1086019
2024年12月29日发(作者：power英文翻译中文)
Western Blotting 检测感染树突状细胞中的的病毒蛋白
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris 碱 7.55g，甘氨酸(电泳级，pH8.3) 47 g，25 ml 10% SDS(电
泳级)，加 ddH2O 溶解定容至 500 ml。
12%SDS 聚丙烯酰胺（分离胶，10ml）：水 3.3 ml，30%丙烯酰胺溶液 4 ml，1.5 M Tris(pH8.8)
2.5 ml，10% SDS 0.1 ml，10%过硫酸铵 0.1 ml，TEMED 0.004 ml。
5%SDS 聚丙烯酰胺（积层胶，3ml）：水 2.1 ml，30%丙烯酰胺溶液 0.5 ml，1.0 M Tris (pH6.8)
0.38 ml，10% SDS 0.03 ml，10%过硫酸铵 0.03 ml，TEMED 0.003ml。
考马斯亮蓝染色液：90ml 甲醇∶水(1：1) ，10 ml 冰乙酸，0.25 g 考马斯亮蓝R250。
脱色液：90 ml 甲醇∶水(1：1)，10 ml 冰乙酸。
5.2.1.7 Western blot 缓冲液
电转缓冲液：39 mM 甘氨酸，48 mM Tris 碱，0.037% SDS（电泳级），20% 甲
醇。配制 1000ml 转移缓冲液，需称取 2.9g 甘氨酸，5.8g Tris 碱，0.37g SDS，加 200ml
甲醇，加水至总量为 1000 ml
TBS(pH8.0)：10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl。
TBST：含 0.05% Tween-20 的 TBS。
Western-blot 底物液：针对 HRP 标记二抗的 TMB 显色液为 Promega 公司产品。
丽春红 S（10×）贮存液：2 g 丽春红 S，30 g 三氯乙酸，30 g 磺基水杨酸，加
水至 100 ml。
一 蛋白样品准备
将适量的细胞样品，用 PBS（pH7.4）吹打细胞使之分散脱落，然后低速离心（2000rpm
10min），收集细胞沉淀，用 PBS 洗 1 次后，按照文献（萨姆布鲁克等，1996）所述方法
进行样品的处理，加入等量 2×SDS-PAGE 上样缓冲液（含 50 mM DTT 或不含 50 mM
DTT）重悬，混匀，95℃水浴10 min，然后置冰上等待上样，进行 SDS-PAGE 和 Western blot
分析。
二 SDS-PAGE 电泳
（1）配胶：按萨姆布鲁克等（1996）方法制备 12%分离胶和 5%集层胶。
（2）倒胶：夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板，将制好的 12%的 SDS 丙烯酰胺分离
胶约 5 ml 迅速灌入两玻板的间隙中，留出灌注积层胶所需空间，在分离胶上加入一层异丁
醇，置 37℃温室聚合 45 min，分离胶聚合后，倾出覆盖层液体，用去离子水洗凝胶顶部数
次，用纸巾吸净残留液体，再将刚制好的 5%积层胶灌入分离胶上，立即插入梳子，置 37℃
温室聚合 45 min，待胶全部聚合后移出梳子，用水洗去加样槽的残留液体，用针头拨掉加
样槽的胶将齿弄直，固定于电泳装置。
（3）电泳：往电泳装置加入适量 1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取处理好的样品上样，每
孔上 20µl 样品。接通电源，电压调到 80V，待溴酚蓝指示剂跑到分离胶时，将电压调到
120V，等溴酚蓝指示剂跑到分离胶底部（约需 2h）时断电，结束电泳。
（4）染色与脱色：结束电泳后，取出凝胶，置于考马斯亮蓝染料 R250 中染色 4 h 以
上，取出放入脱色液中脱色数次，每次 30-60 min。观察分析并拍照。
三 Western blotting 检测分析
（1）电转：当 SDS-PAGE 电泳结束后，取 SDS-PAGE 电泳后的凝胶，不经染色，直
接用 Bio-RAD 公司 Mini Trans-Blot Electrophoretic Cell 转印装置将蛋白带电转印到
硝酸纤维素滤膜（NC）上，以 0.65mA/cm2电转印 2 h。具体操作如下：用蒸馏水淋洗石
墨板，用不被吸收的纸巾擦干。戴上手套，切 6 张 3 mm 滤纸和 1 张 NC。滤纸和 NC 的
大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶。否则，两滤纸边缘的接触会造成电流短路，把
NC 漂浮于一盘去离子水的上面，借毛细作用使 NC 从下往上润湿后，将 NC 完全浸没于
水中，浸泡 5 min 以除去 NC 上残留的气泡，用软铅笔在NC 一角做标记。在一托盘中加
入少量电转缓冲液，把 6 张滤纸浸泡于其中。戴上手套安装转移装置，平放底部电极（将
为阳极），石墨一边朝上，在这一电极上放置 3张浸泡过的滤纸，精确对齐，赶出气泡，把
NC 放在滤纸上，保证对齐，没有气泡。从电泳槽上取下凝胶，转移到去离子水中略为漂洗
一下，然后精确平放于 NC 上，凝胶左下角与 NC 标记对齐，戴手套排除气泡。把最后 3
张滤纸放在凝胶上方，同样保证精确对齐不留气泡。将靠上方的电极（阴极）放于夹层物上，
石墨一边朝下，连接电源，根据凝胶面积按 0.65mA-1.0mA/cm2接通电流，电转移 1.5-2 h。
（2）染色：转膜结束后，断开电源，逐一掀去各层，把凝胶（为观察蛋白转移的程度）
及 NC 转移至丽春红染色液中，染色至 NC 上出现蛋白带，用软铅笔标出作为分子量标准
的参照蛋白位置。然后用去离子水漂洗 NC，其间换水数次。
（3）封闭：把 NC 于 TBST 中漂洗一下，放入可加热密封的塑料袋中，按滤膜面积
0.1-0.15ml/cm2的量加入封闭液（含 1% BSA 的 TBST），尽除气泡后密闭袋口，平放于摇
床上室温平缓摇动温育 1-2h 或 4℃过夜。剪开塑料袋弃去封闭液。
（4）一抗与靶蛋白结合：把 NC 放入一新的塑料袋中，按 0.1-0.15ml/cm2加入经封闭液
适宜稀释的一抗，排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育 1h。剪开塑料袋口，将 NC
用 TBST 洗 4-6 遍，每次 5-10min。
（5）二抗与靶蛋白结合：把 NC 放入一新的塑料袋中，按 0.1-0.15ml/cm2加入用封闭液
适宜稀释的二抗，排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育 0.5-1h。再将 NC 用 TBST
洗 4-6 遍，每次 5-10min。再用 TBS 洗 2 遍，每次 5-10 min。
（6）加入底物显色：把 NC 放入以 0.01 M Tris-Cl（pH7.6）配制的 10ml 底物溶液
（DAB-H2O2）避光显色 1-15 min，一旦出现蛋白带，立即取出NC，用ddH2O 漂洗以终
止反应并照相。或将 NC膜放入 Enhanced chemiluminescence Western blot detection
substrate A 和 B 液的等量混合液中进行避光显色 1-5 min 后，吸干 NC 膜多余底物直接
放入 Molecular Image Station 2000MM（Kodak）进行曝光并照相。
版权声明：本文标题：SDSPAGE-WESTERNBLOTING 内容由网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：http://www.roclinux.cn/p/1735516715a1673814.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。
发表评论