敲除hdac8基因对斑马鱼低温耐受能力的影响

2023年12月

DOI:

10.16535/.2023-061

第38卷第6期

大连海洋大学学报

JOURNALOFDALIANOCEAN

UNIVERSITY

Vol.38

No.6

Dec.

2023

文章编号

:2095-1388(2023)06-0964-08

敲除hdac8基因对斑马鱼低温耐受能力的影响

(1.上海海洋大学

水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海

201306;2.上海海洋大学

水产科学国家级实验教学示范中

史雪灵

1,2

,罗军涛

1,2

,罗贝贝

1,2

,韩兵社

1,2

,张俊芳

1,2∗

心,上海

201306)

摘要:

为探究敲除组蛋白去乙酰化酶8基因

(histonedeacetylase8,

hdac8)

对斑马鱼(Danio

rerio)低温耐

受能力的影响,采用组织学、生理和生化等方法,研究了低温(8

℃)

短期胁迫下hdac8基因敲除

(hdac8

-

/

-

)斑马鱼和野生型(WT)斑马鱼的组织损伤、氧化应激相关指标及其凋亡相关基因表达的变化。

14.5h,WT斑马鱼的LT

50

为21.5

h;HE染色显示,低温胁迫下,hdac8

-

/

-

斑马鱼鳃丝、肝脏和骨骼肌相

结果表明:低温胁迫下,hdac8

-

/

-

斑马鱼的半数致死时间(LT

50

)明显缩短,hdac8

-

/

-

斑马鱼的LT

50

为

较于WT斑马鱼损伤更加严重;28

℃下,WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平无

显著性变化(P>0.05),而hdac8

-

/

-

斑马鱼的ATP水平则显著降低(P<0.05);低温胁迫下,hdac8

-

/

-

斑马

鱼的ROS和MDA水平显著高于WT斑马鱼(P<0.05),而ATP水平则显著低于WT斑马鱼(P<0.05);RT-

qPCR显示,28℃下,hdac8

-

/

-

斑马鱼caspase3基因表达显著上调(P<0.05),其他抗氧化与凋亡相关基因

无显著性变化(P>0.05);低温胁迫下,WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼sod、cat、caspase3、caspase9和bax基因表达

水平显著上调(P<0.05),且hdac8

-

/

-

斑马鱼的这5种基因表达水平均显著高于WT斑马鱼(P<0.05)。研

究表明,敲除hdac8基因显著降低了斑马鱼的低温耐受能力,并促进了低温氧化应激损伤和细胞凋亡。

关键词

:

斑马鱼;组蛋白去乙酰化酶8基因;低温耐受;氧化损伤;细胞凋亡

中图分类号

:S

965.9　　　　

文献标志码

:A

　　鱼类对水环境的温度变化很敏感,大多数鱼类

都有适宜生存的温度范围,当水温低于鱼类耐受范

甚至造成鱼类死亡

[1-3]

。据报道,冬季寒流的侵袭

会使黄姑鱼(Nibea

albiflora)和罗非鱼(Oreochro-

氧化系统中发挥重要作用的酶,主要包括超氧化物

歧化酶(superoxide

dismutase,SOD)、过氧化氢酶

围时,低温胁迫会直接影响其生长、代谢和繁殖,

(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(gluta-

thioneperoxidase,GPx)

[2]

。另有研究发现,过量

的ROS会诱导鱼类启动细胞凋亡

[6]

。短期低温胁

以维持内环境的稳定和正常生理活动

[6]

。凋亡细

胞如果不能被吞噬细胞及时清除,就会导致凋亡细

胞大量积累,最终引起组织结构和功能的损害

[7]

。

Caspase家族在细胞凋亡中起到关键作用,其

迫通过机体细胞凋亡的级联反应来清除受损细胞,

mismossambicus)等经济鱼类大规模死亡,造成巨

大的经济损失

[4]

。因此,研究鱼类低温耐受机制

在水产养殖和种质资源保护方面具有重要的意义。

耐受低至6

℃或超过38℃的季节性温度波动,还

斑马鱼(Danio

rerio)属于广温性鱼类,能够

可以在低温(8

℃)中短期生存,较适合成为鱼类

低温耐受机制研究的模型

[5]

。低温胁迫会刺激鱼

的机体产生大量活性氧(ROS),如果不及时清除

会打破氧化和抗氧化平衡,造成生物体氧化损

伤

[2]

,而少量ROS作为信号分子可在免疫和代谢

中起到重要作用

[1]

。正常情况下,抗氧化系统能

够将鱼机体内的ROS维持在较低水平。在鱼类抗

中,Caspase3介导的信号传递途径存在于绝大多数

的细胞凋亡反应过程中

[8]

。低温会诱导青鳉(Ory-

ziaslatipes)鳃组织发生细胞凋亡

[9]

;军曹鱼

(Rachycentron

canadum)和斜带石斑鱼(Epinephelus

起caspase家族、bcl-2(B-cell

lymphoma-2)、bax

coioides)的细胞凋亡途径受到低温的调控,从而引

(bcl-2-associatedX)等凋亡基因表达发生变化

[10-11]

。

　收稿日期:2023-03-26

　基金项目:

上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科创字(2019)第1-2号];国家自然科学基金面上项目(81770165);上海市教委水产

一流学科建设项目

　作者简介:

史雪灵(1998—),女,硕士研究生。E-mail:215259514@

　通信作者:

张俊芳(1976—),女,教授,博士生导师。E-mail:jfzhang@

第6期史雪灵,等:

敲除hdac8基因对斑马鱼低温耐受能力的影响

965

因此,检测氧化、抗氧化和细胞凋亡的相关指标能

够反映鱼类低温耐受能力。

组蛋白去乙酰化酶8(histone

deacetylase

HDAC8)

8,

残基乙酰化状态

可特异性调控组蛋白和非组蛋白赖氨酸

[12]

巨噬细胞在内的多种免疫细胞的分化

。有研究表明,HDAC8在包括

族

。HDAC8负向调控转录

、激活和凋亡

中发挥了作用

[13]

bcl-2家

BMF),

,干扰

从而影响结肠癌细胞凋亡

bcl-2修饰因子(bcl-2

modifying

[14]

factor,

抑制会导致T细胞淋巴瘤中线粒体细胞色素

。HDAC8

C

的

释

放和caspase3的激活,促进细胞凋亡

[15]

细胞中也发现,敲降hdac8会影响细胞增殖和凋

。在肝癌

亡,引起细胞凋亡途径中bax的上调

[16]

驯化斑马鱼成纤维(ZF4)细胞的RNA-seq

。在低温

数据中

发现,hdac8的转录水平显著降低

[17]

hdac8可能与低温相关。随后李飞

[18]

敲降了

,这提

ZF4

示

细胞的hdac8,发现caspase3表达水平显著上调,

促进了细胞凋亡。然而,hdac8是否会通过细胞凋

亡参与鱼类低温耐受机制尚不清楚。

本研究中探究了敲除hdac8基因对斑马鱼低温

耐受能力的影响,首先检

)

测

斑马鱼在低温下的半

野生型(WT)和

hdac8基因敲除(hdac8

-

/

-

数致死时间(the

medianlethal

对低温胁迫下WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼的鳃丝

time,LT

50

);

、

接着

肝脏

及骨骼肌切片进行HE染色并观察组织结构损伤;

然后在28

℃和8

鱼ROS、丙二醛

℃

(MDA)

下,检测了

及三磷酸腺苷酶

WT和hdac8

-

/

-

斑马

(ATP)

qPCR),

的含量;

检测了抗氧化相关基因

最后通过实时荧光定

(sod

量

、

PCR

cat和

(

gpx

RT-

和凋亡相关基因(caspase3、caspase9、bcl-2、bax

)

和bcl-2/bax)在低温胁迫下转录水平的变化,以

期为鱼类低温耐受机制的研究提供数据参考。

1　材料与方法

1.1　材料

试验鱼:上海海洋大学水产种质资源发掘与利

用教育部重点实验室已成功构建hdac8

-

/

-

斑马鱼模

型

[19]

环水中

。

,

WT

水温稳定在

和hdac8

-

/

-

斑马鱼养殖在曝气处理的循

(28±1)℃,pH为7.0~7.8。

照明系统按照14

试剂:苏木

h

素

光周期和

伊红(

10

HE

h暗周期交替进行

)染色试剂盒

。

(E607318)

公司;活性氧检测试剂盒

购自生工生物工程

(S0033S)、

(上海)

ATP

股份有限

检测试

剂盒(S0026)购自上海碧云天生物技术有限公

司;丙二醛检测试剂盒(A003-1)

(17050601)购自Bio-Rad

Western

购自南京建成

生物工程研究所;Clarity

TM

公

ECL

司;

Substrate

0.

显影液NC膜

(orb329785)

45μm(abs960)

购自Biorbyt

购自Abisn

公司

公司

;TRIzol

;HDAC8

TM

抗体

(15596026)

Reagent

司

thesis

;TransScript

购自赛默飞世尔科技

®

(中国)有限公

(AU341

Super

UniAll-OneFirst-StrandcDNASyn-

)、

Mix

Perfectstart

forqPCR

®

One-Step

Green

。

qPCR

gDNA

SuperMix

Removal

1.

(AQ601)

2　方法

购自全式金生物公司

1.

hdac

2.

8

1　

-

/

-

斑马鱼各

低温耐受

20

能

尾置于装有

力检测　取

10

3月龄WT和

缸中,将鱼缸置于培养箱中,用渔网隔开鱼缸

L循环水的鱼

。依

照Hu等

[20]

设计的逐级降温策略(图1),从28

以1

以0.

℃

5

/h的速度缓慢降低到

匀速降低到12℃

18

并驯化

℃并驯化

12

12h,再

℃

0.5℃/

℃

h匀速降到

/h

8℃。当斑马鱼出现失去平衡现

h,最后以

象时,迅速捞出置于28

正常,即视为死亡,并记录死亡时间

℃循环水中,

。

若不能恢复

半数致死时

间指冷处理(8

时间。

℃)开始至每组斑马鱼死亡一半的

图1　降温策略

Fig.1　Coolingstrategy

将10月龄的WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼进行低温处

理4

,

h,

迅速转移到体式显微镜下解剖

用质量浓度为168

麻醉

mg/L麻醉剂

,取鳃丝

(三卡因

、肝

)

1.

脏、肌肉和脑组织用于后续试验。

4%

2.

的多聚甲醛在

2　组织学分析

4℃

下固定

将鳃丝和肝脏用体积分数为

24

数为4%的多聚甲醛在4

h;肌肉用体积分

乙醇中脱水。经二甲苯透明后

℃下固定

,进行石蜡包埋

48h,置于梯度

。将

包埋材料进行横向连续切片,切片厚度为7

使用苏木素伊红(HE)染色,中性树胶封片。

μm。

1.

裂解液研磨

2.3　蛋白表达分析

,超声提取总蛋白

　将脑组织加入

。用多功能酶标仪测

RIPA细胞

定蛋白浓度后,

V,

用

1

SDS-PAGE

h)分离蛋白

凝胶电泳

。将蛋白转移到

(电泳程

序设置为180

966

大连海洋大学学报　　　　　　　　　　　　第38卷

NC

液封闭

膜(

β-actin

用TBST

和

2

电泳程序设置为

h。

清洗

HDAC8

按照

NC膜

抗体

1∶

100V,1h)后,用封闭

3次后

,

2

在

000

,

4

比

加入

℃

例

下摇床孵育过夜

用封闭液稀释

HRP标记的二抗

。

稀释液(1∶2

剂盒显色后,

次

在

。

000),

Amersham

使用显影液化学发光

在摇床上孵育2

TBST清洗3

Imager680下拍照检测

(ECL)

h,再用

试

1.2.4　氧化应激损伤相关指标检测　

。

鱼,按照活性氧检测试剂盒(S0033S)

取斑马鱼全

和丙二醛

检测

MDA

试

(S0026)

含量

剂盒

说明书检测

。取

(A003-1)

肌肉组

ATP

织

说

,

明

按

书

照

方

ATP

法检

检

测

测

ROS

试剂

和

盒

1.2.5　基因表达量分析　

含量

采用

。

鱼全鱼的总RNA,按照反转录试剂盒说明书合成

TRIzol法提取斑马

cDNA。

(sod、cat

参考

和gpx

Wu

)

等

[21]

引物;

方法设计抗氧化相关基因

计凋亡相关基因(caspase3、

利用

caspase

NCBI

9、

网站

bax

BLAST

和bcl-2)

设

引物(表1)。以斑马鱼β-actin为内参,检测WT

和hdac8

-

/

-

斑马鱼中抗氧化及凋亡相关基因的相对

表达量,每个样品设置3个技术重复,采用2

-

ΔΔCt

方法计算基因表达量

[17]

表1　试验引物及其序列

。

Tab.1　Primersequencesusedinthisstudy

基因

gene　引物序列primersequence(5′-3′)

sod

F:GGCCAACCGAT

R:

GTGTTAGA

F:

CCAGCGTTGCCAGTTTTTAG

cat

R:

AGGGCAACTGGGATCTTACA

gpx

F:

TTTATGGGACCAGACCTTGG

R:

ACCTGTCCGCGAAACTATTG

caspase3

F:

TGACTGTTGTGCCTCAAAGC

R:

GATCGCAGGACAGGCATGAA

caspase9

F:

TGCGCAACTGTCTGGTCATT

R:

TTCTTCAGCGGCACAGGTTA

bax

F:

GTCTGGTTGCCTTGCTCTGTA

R:

CAGGGTGGATGGGACGGAAT

bcl-2

F:

TTGCGAATCACCAATGCTGTG

R:

AATGGAGGTTGGGATGCCTT

hdac8

F:

CCAAGCCGAGCACTTTTGTT

R:

GGCTTATTGAAATACATGAGGGTCG

β-action

F:

R:

CTTTGAGCAGGAGATGGGAACC

CCACCGGACAGTCATAACCC

GATTCCATACCCAGGAAGG

1.3　数据处理

本试验中所有试验均设置3个样品重复,试验

数据采用平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采

用Image

采用

J

Origin

软件对

软件对试验数据进行单因素方差分

Western

析;

blot试验结果进行定量分

析(one-way

ANOVA),采用Duncan

法进行组间多

重比较,显著性水平设为0.05。

2　结果与分析

2.1　敲除hdac8基因对斑马鱼低温耐受能力的影响

对WT和

hdac8

-

/

-

斑马鱼进行低温(8

理,检测其低温耐受能力。从图2可见:

℃

相较于

)处

其

WT

LT

斑马鱼

50

为14.

,hdac

5

h,

8

-

/

-

而

斑马鱼的存活时间明显缩短

WT斑马鱼则为21.5

,

和hdac8

-

/

-

斑马鱼的体质量或体长与存活时间之间

h;WT

无显著相关性(P>0.05)。这表明,敲除hdac8基

因降低了斑马鱼的低温耐受能力。

图2　斑马鱼低温耐受能力检测

Fig.2　LowtemperaturetolerancetestingofDaniorerio

2.2　低温胁迫下斑马鱼hdac8基因和蛋白表达变化

8℃的斑马鱼脑组织进行

WT斑马鱼在低温(8

RT-qPCR

℃)下处理

和Western

4h,取

检测低温下hdac

blot,

28、

3可见,相较于28

8

mRNA

℃,低温胁迫后的斑马鱼

和蛋白的表达改变。

hdac

从图

mRNA和蛋白表达均发生了显著降低(P<0.05)。

8

第6期史雪灵,等:

敲除hdac8基因对斑马鱼低温耐受能力的影响

967

∗表示与对照组有显著性差异(P<0.05)。∗meanssignificantdifferencecomparedwiththecontrol(P<0.05).

图3　低温胁迫下斑马鱼hdac8

mRNA和HDAC8蛋白表达的变化

Fig.3　Changesinhdac8mRNAexpressionandHDAC8proteinlevelofDaniorerioexposedtolowtemperaturestress

2.3　低温胁迫下hdac8

-

/

-

斑马鱼的组织学观察

WT和hdac8

-

/

-

可见:28

℃下,WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼之间ROS和

取鳃丝、肝脏及骨骼肌切片进行HE染色。低温胁

迫下,WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼的鳃丝均出现不同程

度的鳃小片折叠破损,hdac8

-

/

-

斑马鱼在黑色圆圈

斑马鱼低温(8

℃)处理4h,

MDA水平无显著性差异(P>0.05),低温(8℃)

处理后,两组鱼的ROS和MDA水平均显著增加

(P<0.05),且

hdac8

-

/

-

斑马鱼的ROS和MDA水平

相较于WT斑马鱼有显著升高(P<0.05);28

℃

下,hdac8

-

/

-

斑马鱼的ATP水平显著低于WT斑马

鱼(P<0.05),低温处理后,WT和hdac8

-

/

-

斑马

鱼的ATP水平均显著降低(P<0.05)。这表明,

敲除hdac8会加重斑马鱼氧化应激损伤,导致线粒

体膜受损,影响ATP的产生。

2.5　低温胁迫下敲除hdac8后抗氧化基因的变化

28、8℃的斑马鱼全鱼进行凋亡相关基因mRNA水

处出现明显断裂现象,鳃小片间分界模糊(图4A、

D);WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼的肝脏均出现大量空

泡,hdac8

-

/

-

斑马鱼在黑色箭头处出现更明显的大

空泡(图4B、E);WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼的骨骼肌

在黑色圆圈处间隙较大(图4C、F)。

均出现少量空隙,hdac8

-

/

-

斑马鱼出现更多空隙,

将WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼低温处理4

h后,取

平检测。从图5可见:28

℃下,WT和hdac8

-

/

-

斑

马鱼的sod、cat和gpx

mRNA水平均无显著性变化

(P>0.05);8℃下,其sod、cat和gpx的mRNA

3个基因的mRNA水平均显著高于WT斑马鱼

A~C为WT斑马鱼;D~F为hdac8

-

/

-

斑马鱼。A和D为鳃丝,

黑色圆圈处对应鳃小片折叠破损;B和E为肝脏,箭头处对应空

泡;C和F为肌肉,黑色圆圈处对应肌原纤维间产生的空隙。

A

-

C,WTzebrafish;D

-

F,hdac8

水平均显著升高(P<0.05),且hdac8

-

/

-

斑马鱼这

(P<0.05)。这表明,低温胁迫引起hdac8

-

/

-

斑马

鱼的抗氧化相关基因上调,进行抗氧化清除ROS。

-

/

-

ments,theblackcirclecorrespondstothefoldeddamageofthegills;

,gillfila-

2.6　低温胁迫下敲除hdac8后凋亡基因的变化

BandE,liver,theblackarrowcorrespondstothecavitation;Cand

F,skeletalmuscle,andtheblackcirclecorrespondstothespacecre-

28、8℃的斑马鱼全鱼进行抗氧化相关基因mRNA

将WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼低温处理4

h后,取

atedbetweenmyofibrils.

水平检测。从图6可见,28

℃下,hdac8

-

/

-

斑马鱼

图4　低温胁迫下斑马鱼的组织学观察

Fig.4　HistologicalobservationsofDaniorerioexposed

tolowtemperaturestress

caspase3的

mRNA水平显著上调(P<0.05),其他

凋亡基因无显著性变化(P>0.05);8

℃下,WT和

hdac8

-

/

-

2.4　低温胁迫下敲除hdac8后斑马鱼的氧化应激

WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼低温(8

℃)处理4h

后,取28

℃和8℃的斑马鱼全鱼进行ROS和MDA

水平均显著升高(P<0.05),且hdac8

-

/

-

斑马鱼的

caspase3、caspase9、bax和bcl-2

mRNA水平均显著

斑马鱼的caspase3、caspase9和bax的

mRNA

高于WT斑马鱼(P<0.05);无论在哪个温度下,

hdac8

-

/

-

斑马鱼的bcl-2/bax值均显著低于WT斑马

鱼(P<0.05)。这表明,hdac8可能通过抑制细胞

含量检测,取肌肉组织进行ATP含量检测。从表2

968

大连海洋大学学报　　　　　　　　　　　　第38卷

表2　低温胁迫下斑马鱼ROS、MDA和ATP含量的变化

Tab.2　ChangesinROS,MDAandATPcontentsinDaniorerioexposedtolowtemperaturestress

温度

temperature/℃

28

8

hdac8

-

/

-

斑马鱼

hdac8

-

/

-

斑马鱼

WT斑马鱼

WT斑马鱼

组别group相关荧光强度ROS

565.55±79.78

aA

593.77±64.89

aA

MDA/(μmol·mg

-

1

prot)

0.73±0.03

aA

0.79±0.03

aA

0.84±0.01

aB

ATP/(μmol·L

-

1

)

166.64±4.49

aA

80.58±1.16

bA

49.69±9.68

bB

　注:同列中标有不同小写字母者表示同一温度下不同斑马鱼之间有显著性差异(P<0.05);标有不同大写字母者表示同一种斑马鱼不同

温度间有显著性差异(P<0.05);标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。

3

225.78±126.22

bB

1803.83±154.33

aB

0.89±0.02

bB

126.25±12.33

aB

Note:ThemeanswithdifferentletterswithinthesamecolumnwithinthesametemperaturearesignificantlydifferentbetweenWTand

hdac8

-

/

-

ze-

brafishatthe0.05probabilitylevel;Themeanswithdifferentcapitalletterswithinthesamecolumnwithinthesamezebrafisharesignificantlydifferent

atdifferenttemperaturesatthe0.05probabilitylevel,andthemeanswiththesameletterarenotsignificantdifferencesbetweengroups.

标有不同小写字母者表示同一温度下不同斑马鱼之间有显著性差异(P<0.05);标有不同大写字母者表示同一种斑马鱼不同温度间有显

著性差异(P<0.05);标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05),下同。

ThemeanswithdifferentletterswithinthesametemperaturearesignificantlydifferentbetweenWTand

hdac8

-

/

-

zebrafishatthe0.05probabilitylev-

el;Themeanswithdifferentcapitalletterswithinthesamezebrafisharesignificantlydifferentatdifferenttemperaturesatthe0.05probabilitylevel,

andthemeanswiththesameletterarenotsignificantdifferencesbetweengroups,etsequentia.

图5　低温胁迫下斑马鱼抗氧化相关基因表达的变化

Fig.5　ChangesinantioxidantrelatedgenesexpressionlevelinDaniorerioexposedtolowtemperaturestress

图6　低温胁迫下斑马鱼凋亡相关基因表达的变化

Fig.6　ChangesinapoptosisrelatedgenesexpressionlevelinDaniorerioexposedtolowtemperaturestress

凋亡参与低温应激过程。

3　讨论

3.1　敲除hdac8基因对斑马鱼低温胁迫下行为和

组织损伤的影响

时会造成鱼类死亡

[1,22]

。有研究发现,鱼类的行为

是环境压力下最直观的反应,鱼类受到短时间的低

温胁迫会出现剧烈运动,随着胁迫时间的延长,鱼

类会慢慢减少游动

[23]

。本研究中,低温胁迫试验

低温胁迫会影响鱼类生长、代谢和繁殖,严重

显示,在8

℃下处理2h时,hdac8

-

/

-

斑马鱼基本

停止游动,并停留在鱼缸底部,而WT斑马鱼在胁

迫6

h后仍能缓慢游动,且hdac8

-

/

-

斑马鱼的LT

50

显著缩短。此外,WT和hdac8

-

/

-

斑马鱼的体质量

和体长与存活时间之间无显著相关性。这些数据说

明,敲除hdac8会减弱斑马鱼的低温耐受能力,但

可能不是通过调控生长发育过程影响其耐温性能。

鱼类中鳃和肝脏是低温胁迫的主要靶器官

[24]

。

本研究中组织学分析发现,低温下hdac8

-

/

-

斑马鱼

鳃丝和肝脏受到的损伤比WT斑马鱼更严重。黄姑

第6期史雪灵,等:

敲除hdac8基因对斑马鱼低温耐受能力的影响

969

鱼在低温胁迫下鳃丝也出现了类似的损伤现象,该

研究同时还发现,低温处理后出现异常生理行为,

可能是因为鳃丝受损引发的缺氧

clarkii)在低pH胁迫下

。克氏原螯虾

,进而影响呼吸效

率,最终造成死亡

[24]

(Procambarus

[25]

,鳃的上皮细胞剥落,肝

胰腺出现许多空泡

结果类似。本研究中,

,

敲除

此组织损伤现象与本研究

hdac8基因会加重低温

胁迫下的组织损伤,笔者推测,hdac8基因可能在

保护机体组织免受低温损伤过程中起着一定作用。

3.2　敲除hdac8基因对斑马鱼低温胁迫下抗氧化

能力的影响

低温胁迫下,鱼类会产生大量的ROS,不及

时清理就会造成机体氧化应激反应

[2]

统和MDA常被作为ROS氧化损伤的衡量指标

。抗氧化系

[21]

SOD

。

够清

能够清除体内活性氧自由基

ROS

除过氧化氢,以防止羟基自

,

由

CAT

基

和

和多

GPx

余

能

的

膜,发生脂质过氧化反应

产生

[2]

。生物体积累过量的

,并产生

ROS

MDA

会攻击生物

等脂质过

氧化产物。积累过多的MDA会改变细胞膜的流动

性和通透性,对细胞、组织及生物体产生危害

[1]

在低温胁迫对日本对虾(Marsupenaeus

japonicus)

。

的研

MDA

究

伤

[26]

含

中发现,随着胁迫时间的延长对虾体内

ROS

hdac8

和

。本研究中

量显著增加,并对鳃和肝胰腺产生损

-

/

-

MDA

斑马鱼的抗氧化系统在短期应激过程中

含量

,

显

hdac

著

8

-

/

-

高于

斑马鱼

WT斑

在

马

低

鱼

温

;

胁

WT

迫下

和

,

抗氧化相关基因mRNA水平出现增加的趋势。这

些结果表明,在短期低温刺激后,机体内积累过量

的ROS,使斑马鱼脂质过氧化程度增强,而抗氧

化系统积极抵御氧化应激来适应温度变化,但敲除

hdac8引发了低温胁迫下更加激烈的氧化应激反

应。在花鳅(Cobitis

sinensis)、鲤(Cyprinus

carpio)和军曹鱼中也发现,短期冷应激会上调鱼

类抗氧化通路以清除ROS,随着胁迫时间的延长,

相关抗氧化酶的水平会恢复到正常值

[10,27-28]

限温度下,随着胁迫时间的延长并不会出现抗氧化

。但极

酶的恢复期,笔者推测,敲除hdac8基因可能导致

斑马鱼在低温下更易积累ROS。

3.3　敲除hdac8基因对斑马鱼低温胁迫下凋亡相

关基因的影响

过激活内源性细胞凋亡途径

ROS过量积累不仅会引起氧化应激

(线粒体途径

,

)

还会通

导致

细胞凋亡

[6]

动凋亡并形

。

成

在低温下

凋亡小

,

体,

鱼类体内细胞能快速启

以维持内环境稳定。

Bcl-2

和bax

家族主要调控线粒体途径的细胞凋亡

是这个家族的两个重要基因。bcl-2/bax

,

比值

bcl-2

的降低代表细胞凋亡启动,进一步刺激caspase9,

导致caspase3的激活

[29-30]

teobagrusfulvidraco)低氧胁迫中发现

。在瓦氏黄

,bcl-

颡鱼

2/bax

(Pel-

比

值的增加可抑制细胞凋亡并保护细胞,这可能是鱼

类在进化中适应的一种保护机制

[31]

现,hdac8与调控凋亡的Bcl-2家族和

。

Caspase

另有研究发

家族

密切相关,

。

hdac

本研究中

8的缺失或抑制对细胞凋亡有促进

作用

[14-16]

caspase3

mRNA水平显著高于

,28℃下

WT

hdac

斑马鱼

8

-

/

-

斑马鱼的

下hdac8

-

/

-

斑马鱼的caspase3和caspase9

,而8℃

平相较于WT斑马鱼显著增加,且bcl-2/

mRNA

bax比值

水

显著降低。这说明,敲除hdac8后斑马鱼低温胁迫

下细胞凋亡的程度更高,可能是通过内源性线粒体

途径激活凋亡,从而促进细胞凋亡。在高温和低氧

应激下杂色鲍(Haliotis

mRNA

相关

[32]

表达显著上升

,这与本研究中的结果相类似

,且caspase

diveraicolor

3与氧化应激响应

)的caspase3

hdac8

-

/

-

斑马鱼凋亡水平的升高可能与

。

hdac

由此可见

8

-

/

-

斑

,

马鱼的ATP含量显著减少相关。线粒体膜功能的

紊乱和损伤也会引起线粒体细胞色素C的释放,

激活caspase3介导的凋亡

[33]

量ROS和MDA的积累破坏了斑马鱼的细胞膜

。笔者推测,由于大

,造

成线粒体损伤,导致ATP的产生减少和线粒体细

胞色素C的释放,从而促进细胞凋亡。以上研究

表明,hdac8可能通过调控细胞凋亡在低温耐受机

制中发挥作用,其具体作用机制有待进一步研究。

4　结论

斑马鱼游泳能力减弱

1)在低温胁迫下

,

,

LT

hdac8

-

/

-

斑马鱼相较于WT

50

显著缩短,表明敲除

hdac8

伤和氧化应激损伤比

2)

减弱了斑马鱼的低温耐受能力

在低温胁迫下

WT

,hdac

斑马鱼更严重

8

-

。

/

-

斑马鱼组织结构损

,表明敲除

hdac8

3)

加重了低温下斑马鱼的氧化损伤

敲除hdac8后,斑马鱼caspaspe

。

调;在低温胁迫下,hdac8

-

/

-

斑马鱼多个凋亡相关

3显著上

基因表达显著上调,表明hdac8可能通过调控细胞

凋亡途径影响斑马鱼低温耐受能力。

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(Danio

rerio)

(oratoryofExplorationandUtilizationofAquaticGeneticResources,MinistryofEducation,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,

SHIXueling

1,2

,LUOJuntao

1,2

,LUOBeibei

1,2

,HANBingshe

1,2

,ZHANGJunfang

1,2∗

China;alDemonstrationCenterforExperimentalFisheriesScienceEducation,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract:

Toexploretheeffectsofknockingouthistonedeacetylase8gene(hdac8)onlow-temperaturetolerance

ofzebrafish(Danio

rerio),

thechangesintissuedamageofgillfilaments,liver,andskeletalmuscles,oxidative

stress-relatedindices,andapoptosis-relatedgene(caspase3,

caspase9,bcl-2,bax

and

bcl-2/bax)

expressionwere

detectedin8monthsold

hdac8

deficient(hdac8

-

/

-

)andwildtype(WT)zebrafishexposedtolowwater-tempera-

tureof8℃stressfrom28℃to18℃atarateof1℃/handthento8℃atarateof0.5℃/hbyhistological,

ultsshowedthatthemedianlethaltime

(LT

50

)wassignificantlydecreasedunderlowtemperaturestressin

hdac8

-

/

-

zebrafish,withtheLT

50

of14.5hrela-

tivetotheLT

50

ningshowedthatmoreseveredamagewasobservedinthegill

filaments,liverandskeletalmusclein

hdac8

-

/

-

TheATPlevelin

hdac8

-

/

-

zebrafishshowedverysignificantdecrease(P<0.05)at28℃,withoutsignificant

zebrafishcomparedwithWTzebrafishunderlowtemperaturestress.

differenceinthelevelsofreactiveoxygenspecies(ROS)andmalondialdehydecontentbetweenWTand

hdac8

-

/

-

zebrafish(P>0.05).Underlow-temperaturestress,however,the

hdac8

-

/

-

zebrafishhadverysignificantlyhigher

ROSandMDAlevelsthantheWTzebrafishdid(P<0.05),andverysignificantlylowerATPlevelthantheWT

zebrafish(P<0.05)-qPCRrevealedthattherewassignificantlyup-regulatedexpressionlevelof

caspase3

in

hdac8

-

/

-

andapoptosis-relatedgenes(P>0.05).Underlow-temperaturestress,theexpressionlevelsof

sod,cat,caspase3,

zebrafish(P<0.05)at28℃,withoutsignificantdifferenceintheexpressionlevelsofotherantioxidant

caspase9

and

bax

werefoundtobesignificantlyup-regulatedinbothWTand

hdac8

cantlyhigherexpressionlevelsofthesegenesin

hdac8

-

/

-

-

/

-

clusion,

hdac8

knockoutsignificantlyimpairedthetolerancetolowtemperatureofzebrafish,andpromotedoxida-

zebrafishthanthoseinWTzebrafish(P<0.05).Incon-

zebrafish(P<0.05),signifi-

tivedamageandcellapoptosisatlowtemperature.

Keywords:

Daniorerio;hdac8;

low-temperaturetolerance;oxidativedamage;cellapoptosis